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【摘要】目的:对艾篙挥发油进行体外抑菌作用和体内保护作用进行的实验研究,检测艾篙挥发油体内外抑菌效果。方法:并以红霉素为对照采用琼脂培养基(Mue-H inton)二倍稀释法对艾篙挥发油的最低抑菌浓度(MIC)检测;通过对感染小鼠进行试验性治疗来检测致死保护率。结果:艾篙挥发油对实验菌的MIC90值范围0.78-25μL/mL;对对金葡萄球菌感染小鼠致死保护率20%-50%,对绿脓杆菌感染小鼠死亡的保护率30%-40%,对大肠杆菌感染小鼠死亡的保护率20%-40%。结论:艾篙挥发油体外对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌具有抑菌作用,其抑菌作用优于或等同于红霉素;体内对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌感染 小鼠具有较好的保护作用。
【关键词】艾篙挥发油;最低抑菌浓度;体外抑菌;体内保护
【中图分类号】R-3【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2010)10-042-2
菊科多年生植物艾篙Artemisiaar gyile vel.et Vant.的干燥叶作为中草药,可以就地取材,有较高的药用价值和悠久的应用历史。传统药性理论认为艾篙具有理气血、逐寒湿、温经血、安胎、杀虫止痒等作用。现代医学的药理研究表明,艾篙挥发油是一种广谱的抗菌抗病毒药物,它对细菌和病毒具有抑制和杀伤作用,对呼吸系统疾病有一定的防治作用。艾篙味芳香、苦燥辛散,能理气血、温经脉、逐寒湿、止冷痛,为妇科良药。可用于治疗院腹冷痛,经寒不调,宫冷不孕等症;炒炭止血,可用于治疗虚寒性月经过多,崩漏带下,妊娠胎漏;艾篙捣绒,制成艾条、艾柱,外灸能散寒止痛,温煦气血;煎汤外洗可治湿疮疥癣,祛湿止痒。艾篙化学成分含挥发油0.45%-1.00%,是艾篙抗菌作用的重要成分。油中主要为:一松油醇、8-按叶精、α一侧柏酮(α- thujone)、α一水芹烯(α-pHellandrene),β-T香烯(β-caryopHyllene),茨烯、樟脑、藏茵香酮、反式苇醇(transcarveol)。为了将艾篙更方便、科学地应用于临床,我们提取艾篙挥发油,进行了体外抑菌作用和体内保护作用的研究。
1实验材料
1.1药物
艾篙购于安徽中医学院第一附属医院药房;红霉素片,石药集团欧意药业有限公司出品,批号50404010。
1.2菌种
金黄色葡萄球菌10株(含标准菌株ATCC25923)、大肠杆菌10株(含标准菌株ATCC25922)、绿脓杆菌10株,由本院微生物教研室提供。
1.3培养基
琼脂培养基(Mue-H inton),上海东海医化试剂公司生产,批号0010320。
1.4动物
昆明种小鼠,体重(20士2)g,清洁级,安徽医科大学动物中心提供。
1.5艾篙挥发油制备
取艾篙适量,装入5000mL的蒸溜瓶中,加水浸泡1h ,加水量不得超过3500mL。按《中国药典》2000版(一部)附录XD水蒸气蒸馏法提取挥发油。馏出物含有少量水。加氯化钠少许,置冰箱冷藏24h,使水、油两相分层,再用分液滤斗进行分离,滤得绿色透明的、具有浓郁芳香气味的液体,即艾篙挥发油。
2方法与结果
2.1体外抑菌作用
2.1.1供试菌液的制备将各供试菌种分别接种于供试培养基中,37℃培养24h,选用标准菌落接种于液体培养基中培养6h,调整菌液浓度为108CFU/mL,备用。
2.1.2含药物培养基的制备将试验品及对照品分别加入培养基中做2倍稀释,艾篙挥发油(μL/ml)和红霉素(μg/mL)最终浓度依次为200,100,50,25,12.5, 6.25,3.12,1.56,0.78,同时设空白对照。
2.1.3供试菌接种用接种环分别取供试菌液一环(含菌量约为104 CFU),分别接种于含艾篙挥发油的培养基上和含红霉素的培养基上,37℃培养24h,观察试验结果。艾篙挥发油对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和绿脓杆菌有显著的抑菌作用;其抑制金黄色葡萄球菌的效果等同于红霉素,抑制大肠杆菌、绿脓杆菌的效果大大优于红霉素。结果见表1。
表1 艾篙挥发油和红霉素对实验菌MIC测定结果物(N=10)
实验组 MIC 红霉素(μg/mL) 艾篙挥发油(μL/mL)
大肠杆菌 MIC50 12.50 0.78
MIC90 200 0.78
金黄色葡萄球菌 MIC50 0.78 0.78
MIC90 0.78 0.78
绿脓球菌 MIC50 100 0.312
MIC90 100 25
注:MIC50,MIC90分别为抑制50%,90%所试菌株的MIC值
2.2体内保护试验
2.2.1菌液及药液稀释将3种菌的原菌液用5%高活性干酵母液稀释(增强细菌的毒力)至所需浓度,测出试验菌株的100%最小致死量(MLD)。药液以2%吐温-80为溶剂,艾篙挥发油稀释浓度为120,80,40μg/mL3种溶液。
表2 艾篙挥发油对金葡萄球菌感染小鼠死亡的保护作用
组别 剂量 感染菌量 死亡数 死亡率(%) 死亡保护率(%)
Ml/(kg.d) MLD/CFU
治疗组 6 7.5×108 5 50 50★★
4 7.5×108 5 50 50★★
2 7.5×108 8 80 20★★
对照组 7.5×108 10 100 0
注:与对照组比较,**P<0.01
2.2.2对感染动物保护试验选健康小鼠40只,随机分为3个药物治疗组和1个溶剂对照组,每组10只。以上各组分别腹腔注射0.5mL含1个MLD菌量致小鼠感染,治疗组腹腔注射0.5ml,3种浓度艾篙挥发油,对照组腹腔注射0.5mL 2%吐温-80。各组小鼠每天注射2次,连续用药3d,继续观察至5d。记录感染后5d内各组小鼠的存活数和死亡数,计算死亡保护率,进行X2检验。死亡保护率(%)=(对照组死亡率一药物组死亡率)×100%。结果见表2—表4
表3 艾篙挥发油对绿脓杆菌感染小鼠死亡的保护作用
组别 剂量 感染菌量 死亡数 死亡率(%) 死亡保护率(%)
ML/(kg.d) MLD/CFU
治疗组 6 4×109 6 60 40★★
4 4×109 7 70 30★★
2 4×109 7 70 30★★
对照组 4×109 10 100 0
注:与对照组比较,**P<0.01
表4 艾篙挥发油对大肠杆菌感染小鼠死亡的保护作用
组别 剂量 感染菌量 死亡数 死亡率(%) 死亡保护率(%)
ML/(kg.d) MLD/CFU
治疗组 6 2×109 6 60 40★★
4 2×109 8 80 20★★
2 2×109 10 100 0★★
对照组 2×109 10 100 0
3讨论
在体外抑菌实验中,我们采用Mue-H inton琼脂培养基是因为Mue-H inton琼脂对中药抑制作用的检测灵敏度高,比传统使用的营养琼脂抑菌效果提高2-16倍。在考察药物对体内感染动物保护作用的很多文献中,大部分采用单一的动物模型,但本实验采用3种动物模型进行试验,以便更好地考察艾篙挥发油对体内感染动物保护作用。
研究表明,艾篙对几种常见食品微生物进行抑菌试验,对细菌的抑制效果较好,尤其对金黄色葡萄球菌的效果最好,对绿脓杆菌的效果一般,对大肠杆菌的效果次之。此外,提取液MIC50,在酸性环境中(pH3-6)作用较好,但热稳定性不好,经90℃以上,15min处理其抑菌作用不明显。艾篙具有药源丰富、价格低廉、不良反应小、安全性好的特点而被广泛使用,但艾篙新剂型的研发比较滞后,仍沿用汤剂、灸剂等传统的剂型。我们本着研发艾篙新剂型、方便临床用药为目的设计了本课题。本实验证明了艾篙挥发油体内外的抑菌作用,这对下一步将艾篙挥发油研制成为一种用于预防和治疗创伤感染外用药(喷雾剂)有着重要意义。
参考文献
[1] 任仁安,陈瑞华.中药鉴定学[M].上海:上海科学技术出版社,1996.334.
[2] 周峰,秦路平.植物源生物活性物质的化学成分.生物活性和植物资源[J].药学实践杂志,2000,18(2):96.
[3] 李仪奎.中药药理实验方法学[M].上海:上海科学技术出版社,1991.291.
[4] 陈奇.中药药理研究方法学[M].北京:人民卫生出版社,1996.255.
[5] 魏希颖,金品,左海艳.两种不同培养基对连翘种子挥发油体外抑菌作用的研究[J].中药材,2004,27(1):45.
[6] 李仲兴,王秀华,赵建宏,等.应用M-H琼脂进行连翘体外抗菌实验的疗效观察[J].中国中药杂志,2000.
[7] 贾建波.生姜和革莽皮提取物抗菌作用研究[J].广州食品工业科技,2001,(1):41-44.
【关键词】艾篙挥发油;最低抑菌浓度;体外抑菌;体内保护
【中图分类号】R-3【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2010)10-042-2
菊科多年生植物艾篙Artemisiaar gyile vel.et Vant.的干燥叶作为中草药,可以就地取材,有较高的药用价值和悠久的应用历史。传统药性理论认为艾篙具有理气血、逐寒湿、温经血、安胎、杀虫止痒等作用。现代医学的药理研究表明,艾篙挥发油是一种广谱的抗菌抗病毒药物,它对细菌和病毒具有抑制和杀伤作用,对呼吸系统疾病有一定的防治作用。艾篙味芳香、苦燥辛散,能理气血、温经脉、逐寒湿、止冷痛,为妇科良药。可用于治疗院腹冷痛,经寒不调,宫冷不孕等症;炒炭止血,可用于治疗虚寒性月经过多,崩漏带下,妊娠胎漏;艾篙捣绒,制成艾条、艾柱,外灸能散寒止痛,温煦气血;煎汤外洗可治湿疮疥癣,祛湿止痒。艾篙化学成分含挥发油0.45%-1.00%,是艾篙抗菌作用的重要成分。油中主要为:一松油醇、8-按叶精、α一侧柏酮(α- thujone)、α一水芹烯(α-pHellandrene),β-T香烯(β-caryopHyllene),茨烯、樟脑、藏茵香酮、反式苇醇(transcarveol)。为了将艾篙更方便、科学地应用于临床,我们提取艾篙挥发油,进行了体外抑菌作用和体内保护作用的研究。
1实验材料
1.1药物
艾篙购于安徽中医学院第一附属医院药房;红霉素片,石药集团欧意药业有限公司出品,批号50404010。
1.2菌种
金黄色葡萄球菌10株(含标准菌株ATCC25923)、大肠杆菌10株(含标准菌株ATCC25922)、绿脓杆菌10株,由本院微生物教研室提供。
1.3培养基
琼脂培养基(Mue-H inton),上海东海医化试剂公司生产,批号0010320。
1.4动物
昆明种小鼠,体重(20士2)g,清洁级,安徽医科大学动物中心提供。
1.5艾篙挥发油制备
取艾篙适量,装入5000mL的蒸溜瓶中,加水浸泡1h ,加水量不得超过3500mL。按《中国药典》2000版(一部)附录XD水蒸气蒸馏法提取挥发油。馏出物含有少量水。加氯化钠少许,置冰箱冷藏24h,使水、油两相分层,再用分液滤斗进行分离,滤得绿色透明的、具有浓郁芳香气味的液体,即艾篙挥发油。
2方法与结果
2.1体外抑菌作用
2.1.1供试菌液的制备将各供试菌种分别接种于供试培养基中,37℃培养24h,选用标准菌落接种于液体培养基中培养6h,调整菌液浓度为108CFU/mL,备用。
2.1.2含药物培养基的制备将试验品及对照品分别加入培养基中做2倍稀释,艾篙挥发油(μL/ml)和红霉素(μg/mL)最终浓度依次为200,100,50,25,12.5, 6.25,3.12,1.56,0.78,同时设空白对照。
2.1.3供试菌接种用接种环分别取供试菌液一环(含菌量约为104 CFU),分别接种于含艾篙挥发油的培养基上和含红霉素的培养基上,37℃培养24h,观察试验结果。艾篙挥发油对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和绿脓杆菌有显著的抑菌作用;其抑制金黄色葡萄球菌的效果等同于红霉素,抑制大肠杆菌、绿脓杆菌的效果大大优于红霉素。结果见表1。
表1 艾篙挥发油和红霉素对实验菌MIC测定结果物(N=10)
实验组 MIC 红霉素(μg/mL) 艾篙挥发油(μL/mL)
大肠杆菌 MIC50 12.50 0.78
MIC90 200 0.78
金黄色葡萄球菌 MIC50 0.78 0.78
MIC90 0.78 0.78
绿脓球菌 MIC50 100 0.312
MIC90 100 25
注:MIC50,MIC90分别为抑制50%,90%所试菌株的MIC值
2.2体内保护试验
2.2.1菌液及药液稀释将3种菌的原菌液用5%高活性干酵母液稀释(增强细菌的毒力)至所需浓度,测出试验菌株的100%最小致死量(MLD)。药液以2%吐温-80为溶剂,艾篙挥发油稀释浓度为120,80,40μg/mL3种溶液。
表2 艾篙挥发油对金葡萄球菌感染小鼠死亡的保护作用
组别 剂量 感染菌量 死亡数 死亡率(%) 死亡保护率(%)
Ml/(kg.d) MLD/CFU
治疗组 6 7.5×108 5 50 50★★
4 7.5×108 5 50 50★★
2 7.5×108 8 80 20★★
对照组 7.5×108 10 100 0
注:与对照组比较,**P<0.01
2.2.2对感染动物保护试验选健康小鼠40只,随机分为3个药物治疗组和1个溶剂对照组,每组10只。以上各组分别腹腔注射0.5mL含1个MLD菌量致小鼠感染,治疗组腹腔注射0.5ml,3种浓度艾篙挥发油,对照组腹腔注射0.5mL 2%吐温-80。各组小鼠每天注射2次,连续用药3d,继续观察至5d。记录感染后5d内各组小鼠的存活数和死亡数,计算死亡保护率,进行X2检验。死亡保护率(%)=(对照组死亡率一药物组死亡率)×100%。结果见表2—表4
表3 艾篙挥发油对绿脓杆菌感染小鼠死亡的保护作用
组别 剂量 感染菌量 死亡数 死亡率(%) 死亡保护率(%)
ML/(kg.d) MLD/CFU
治疗组 6 4×109 6 60 40★★
4 4×109 7 70 30★★
2 4×109 7 70 30★★
对照组 4×109 10 100 0
注:与对照组比较,**P<0.01
表4 艾篙挥发油对大肠杆菌感染小鼠死亡的保护作用
组别 剂量 感染菌量 死亡数 死亡率(%) 死亡保护率(%)
ML/(kg.d) MLD/CFU
治疗组 6 2×109 6 60 40★★
4 2×109 8 80 20★★
2 2×109 10 100 0★★
对照组 2×109 10 100 0
3讨论
在体外抑菌实验中,我们采用Mue-H inton琼脂培养基是因为Mue-H inton琼脂对中药抑制作用的检测灵敏度高,比传统使用的营养琼脂抑菌效果提高2-16倍。在考察药物对体内感染动物保护作用的很多文献中,大部分采用单一的动物模型,但本实验采用3种动物模型进行试验,以便更好地考察艾篙挥发油对体内感染动物保护作用。
研究表明,艾篙对几种常见食品微生物进行抑菌试验,对细菌的抑制效果较好,尤其对金黄色葡萄球菌的效果最好,对绿脓杆菌的效果一般,对大肠杆菌的效果次之。此外,提取液MIC50,在酸性环境中(pH3-6)作用较好,但热稳定性不好,经90℃以上,15min处理其抑菌作用不明显。艾篙具有药源丰富、价格低廉、不良反应小、安全性好的特点而被广泛使用,但艾篙新剂型的研发比较滞后,仍沿用汤剂、灸剂等传统的剂型。我们本着研发艾篙新剂型、方便临床用药为目的设计了本课题。本实验证明了艾篙挥发油体内外的抑菌作用,这对下一步将艾篙挥发油研制成为一种用于预防和治疗创伤感染外用药(喷雾剂)有着重要意义。
参考文献
[1] 任仁安,陈瑞华.中药鉴定学[M].上海:上海科学技术出版社,1996.334.
[2] 周峰,秦路平.植物源生物活性物质的化学成分.生物活性和植物资源[J].药学实践杂志,2000,18(2):96.
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[4] 陈奇.中药药理研究方法学[M].北京:人民卫生出版社,1996.255.
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[6] 李仲兴,王秀华,赵建宏,等.应用M-H琼脂进行连翘体外抗菌实验的疗效观察[J].中国中药杂志,2000.
[7] 贾建波.生姜和革莽皮提取物抗菌作用研究[J].广州食品工业科技,2001,(1):41-44.