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【摘 要】本文以食源性致病微生物作为目标菌，利用PCR技术，建立一种快速高效检测冻肉中致病微生物的PCR反应体系。并对反应体系的灵敏度和特异性进行检测分析，得到最适合的快速检测食物中致病微生物的方法。
【关键词】食源性致病微生物;PCR;灵敏度;特异性
1 前言
伴随着国民经济的发展，食品工业规模在不断扩大。但是近年来食源性致病菌是引起食源性疾病的屡见不鲜[1]，以微生物性暴发事件数和发病人数最多，分别为总食源性疾病数的40.93%和56.39%[2]。我国是肉制品生产和消费大国，肉制品易受各种微生物的污染，滋生多种致病菌[3]。大肠杆菌是肉类中较为常见的食源性致病菌，可污染各种肉制品。长期以来，这种病原菌的实验室诊断主要依靠传统的细菌学检测方法，步骤繁琐且需要数日才能得出结论[4]。免疫学检测方法是一种能够将高度专一性的抗原-抗体反应与高度敏感性的酶催化作用结合，但免疫学检测方法一般需要合适数量的纯化细菌，或者对样品进行浓缩用来提高菌液的浓度，所以一般需要进行较长时间的前期增菌[5]。近年来，聚合酶链反应是应用最广泛的分子生物学技术，以其高度保守的核酸序列设计特异性引物进行扩增，用凝胶电泳和紫外核酸检测仪观察结果[6]。
本研究旨在基于PCR技术，用于检测市场中冻肉食品内含有的大肠杆菌的含量，建立一套对冻肉食品中的大肠杆菌进行快速、高效、精准的检测方法，为食源性致病微生物快速检测提供参考。主要内容包括三部分：大肠杆菌的PCR反应体系建立;对大肠杆菌PCR退火温度的反应条件的优化;实例样品检测，确定PCR方法的灵敏度及PCR的特异性分析。
2 材料与方法
2.1 材料及设备
大肠杆菌（由吉林农业科技学院微生物实验室分离菌株）;Taq酶、DNA Marker DL5000均购自百泰克生物技术有限公司;冻肉;SW-079PCR分析仪（宝生物工程大连有限公司）、JY600t电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司）、 LAS 500生物分子成像仪（北京绿绵科技有限公司 ）、FA1004A电子天平（上海精天电子仪器有限公司）、SW-073双人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司）、HH-8数显恒温水浴锅（金坛市科析仪器有限公司）、HZQ-X10CA恒温振荡培养箱（上海一恒科技有限公司）、 FMB20制冰机（上海比朗有限公司）、5424R（冷冻）艾本德台式高速离心机（上海昆士兰生物科技发展有限公司）、PHB-10塞里多斯酸度计（上海旦鼎国际贸易有限公司）等;其它化学试剂均为化学纯。
2.2 方法
2.2.1 引物设计 选择大肠杆菌的编码溶血素基因（hlyA）作为目的基因。用Primer 5.0分析软件分别设计引物，上游引物为F 5`-GCATCATCAAGCGTACGTTCC-3`，下游引物为R 5`-AATGAGCCAAGCTGGTTAAGC-3`。引物由金斯瑞生物科技有限公司合成。
2.2.2 菌种的培养 将保存的菌种取出，37℃水浴快速解冻，取100 μl再接种到100 ml LB液体培养基。37℃，摇床培养过夜。取培养液划线接种于LB固体培养基上，培养，分离出单菌落。挑取平板上的单菌落接种于LB液体培养基培养至对数生长期进行后续试验。
2.2.3 基因组DNA的提取 采用郭新梅，康冀川[7]等人的改良CTAB法。提取1 mL对数期菌液，12000 r/min离心5 min，向细菌沉淀中依次加入10 % SDS 30 μL，CTAB提取缓冲液（Tris- HCl 50 mmol/L，pH值8.0，EDTA 10 mmol/L;NaCl 0.7 mol/L;CTAB 1.5%）150 μL，加蛋白酶K 5 μL， CTAB/NaCl 80 μL，于60℃条件下水浴 40 min;加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1），轻轻混匀，在4℃条件下以转速12000 r/min离心5 min;取上清液，加入400 μL异丙醇混匀，在4℃条件下用转速12000 r/min离心5 min;弃上清液，加入70%的乙醇洗涤沉淀，自然晾干，用100 μL含RNA酶A（20 mg/mL）的TE溶解DNA，于-20℃条件下冷冻保存备用。
2.2.4 食品样品前处理和模板DNA的提取 （1）样品处理：无菌条件下取25 g或25 mL食品样品，放入225 mL灭菌生理盐水中均质，制成10倍梯度稀释液。（2）增菌培养：将菌液接入7.5% NaCl肉汤或胰蛋白胨肉汤中，37℃振荡培养半小时。（3）取菌液4℃条件下4000 r/min离心10 min，取上清液加入另一灭菌离心管中以10000 rpm离心20 min，沉淀依据细菌基因组DNA提取步骤进行提取，利用已经建立的PCR反应程序进行检测。取PCR产物在琼脂糖凝胶上进行电泳，利用凝膠成像系统观察结果。
2.2.5 灵敏度及特异性分析 将致病微生物培养增菌后接种于食品样品中，培养后计数，将已测浓度的菌液用生理盐水稀释，得到稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍的稀释液，取2 mL提取DNA，以各自提取DNA为模板进行PCR检测。
3 结果与分析
3.1 PCR反应条件的优化
PCR退火温度优化结果，为了选择最佳的退火温度，参照查阅的文献，分别选择47.3 ℃、48.4℃、50.0℃、51.7 ℃、53.3℃、54℃进行多重PCR扩增，结果如图1所示。随着退火温度的升高，条带有明显变亮的趋势，但到53.3℃时已变化不大，因此确定53.3 ℃为多重PCR的最佳的退火温度。
3.2 人工污染样品的检测
按照2.2.4的方法将食品进行处理，并提取检测样品的DNA，将提取的冻肉中的DNA进行PCR扩增。观察结果如图2所示，图中出现所需菌种的扩增的特异性条带，并且条带清晰明亮，表明食品中存在大肠杆菌存在，并能成功扩增出结果。 3.3 样品PCR灵敏度检测
将大肠杆菌人工感染冻肉处理液，经培养直接提取DNA，以DNA为模板，进行10倍梯度稀释然后进行PCR检测，从图3可以看出大肠杆菌的最低检测限为2×10-4 ng/μL。
4 结论与讨论
根据本试验的结果表明，选择大肠杆菌的编码溶血素基因（hlyA）作为目的基因设计的特异性引物，引物的特异性较强且互不干扰，可以用于PCR检测大肠杆菌。在PCR反应体系的退火温度的条件优化中确立了53.3℃是最优的退火温度。在冻肉的检测样品中大肠杆菌的最低检测含量为2×10-4ng/μL。本研究在冻肉中检出大肠杆菌具有较强特异性。
本研究中特异性引物的设计存在些问题，在PCR的大肠杆菌的阴性对照中，存在一条不是预估的条带，但是并不影响大肠杆菌的鉴定。所以特异性目的基因的选择显得尤为重要，本试验对大肠杆菌的灵敏度最低检测限较低，通过讨论分析：影响因素大致分为两个，一是检测样品的基因组DNA浓度与含量较低，二是冻肉中脂肪和蛋白质的含量较多，介质成分干扰PCR结果。但大多数的肉制品的致病菌的感染剂量均大于103CFU/ml[8]。所以本试验的灵敏度检测结果对实际的应用具有参考意义。
本试验建立了冻肉中大肠
杆菌的PCR检测方法，大大缩短了检验时间与检验成本。检测出冻肉中的两种致病菌具有很高的特异性、较高的灵敏度、成本低的特点，与实验室中传统的食品中致病菌的检测相比，极大的节省时间，在食品安全检测中具有一定实际应用价值。
参考文献：
[1] 刘秀英，胡怡秀. 全球食源性疾病现状[J].国外医学： 卫生
学分册，2003， 30（4）： 199-205.
[2] 徐君飞，张居作. 2001—2010年中国食源性疾病暴发情况
分析[J]. 中国农学通报， 2012， 28（27）： 313-316.
[3] LI M Y，
【关键词】食源性致病微生物;PCR;灵敏度;特异性
1 前言
伴随着国民经济的发展，食品工业规模在不断扩大。但是近年来食源性致病菌是引起食源性疾病的屡见不鲜[1]，以微生物性暴发事件数和发病人数最多，分别为总食源性疾病数的40.93%和56.39%[2]。我国是肉制品生产和消费大国，肉制品易受各种微生物的污染，滋生多种致病菌[3]。大肠杆菌是肉类中较为常见的食源性致病菌，可污染各种肉制品。长期以来，这种病原菌的实验室诊断主要依靠传统的细菌学检测方法，步骤繁琐且需要数日才能得出结论[4]。免疫学检测方法是一种能够将高度专一性的抗原-抗体反应与高度敏感性的酶催化作用结合，但免疫学检测方法一般需要合适数量的纯化细菌，或者对样品进行浓缩用来提高菌液的浓度，所以一般需要进行较长时间的前期增菌[5]。近年来，聚合酶链反应是应用最广泛的分子生物学技术，以其高度保守的核酸序列设计特异性引物进行扩增，用凝胶电泳和紫外核酸检测仪观察结果[6]。
本研究旨在基于PCR技术，用于检测市场中冻肉食品内含有的大肠杆菌的含量，建立一套对冻肉食品中的大肠杆菌进行快速、高效、精准的检测方法，为食源性致病微生物快速检测提供参考。主要内容包括三部分：大肠杆菌的PCR反应体系建立;对大肠杆菌PCR退火温度的反应条件的优化;实例样品检测，确定PCR方法的灵敏度及PCR的特异性分析。
2 材料与方法
2.1 材料及设备
大肠杆菌（由吉林农业科技学院微生物实验室分离菌株）;Taq酶、DNA Marker DL5000均购自百泰克生物技术有限公司;冻肉;SW-079PCR分析仪（宝生物工程大连有限公司）、JY600t电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司）、 LAS 500生物分子成像仪（北京绿绵科技有限公司 ）、FA1004A电子天平（上海精天电子仪器有限公司）、SW-073双人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司）、HH-8数显恒温水浴锅（金坛市科析仪器有限公司）、HZQ-X10CA恒温振荡培养箱（上海一恒科技有限公司）、 FMB20制冰机（上海比朗有限公司）、5424R（冷冻）艾本德台式高速离心机（上海昆士兰生物科技发展有限公司）、PHB-10塞里多斯酸度计（上海旦鼎国际贸易有限公司）等;其它化学试剂均为化学纯。
2.2 方法
2.2.1 引物设计 选择大肠杆菌的编码溶血素基因（hlyA）作为目的基因。用Primer 5.0分析软件分别设计引物，上游引物为F 5`-GCATCATCAAGCGTACGTTCC-3`，下游引物为R 5`-AATGAGCCAAGCTGGTTAAGC-3`。引物由金斯瑞生物科技有限公司合成。
2.2.2 菌种的培养 将保存的菌种取出，37℃水浴快速解冻，取100 μl再接种到100 ml LB液体培养基。37℃，摇床培养过夜。取培养液划线接种于LB固体培养基上，培养，分离出单菌落。挑取平板上的单菌落接种于LB液体培养基培养至对数生长期进行后续试验。
2.2.3 基因组DNA的提取 采用郭新梅，康冀川[7]等人的改良CTAB法。提取1 mL对数期菌液，12000 r/min离心5 min，向细菌沉淀中依次加入10 % SDS 30 μL，CTAB提取缓冲液（Tris- HCl 50 mmol/L，pH值8.0，EDTA 10 mmol/L;NaCl 0.7 mol/L;CTAB 1.5%）150 μL，加蛋白酶K 5 μL， CTAB/NaCl 80 μL，于60℃条件下水浴 40 min;加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1），轻轻混匀，在4℃条件下以转速12000 r/min离心5 min;取上清液，加入400 μL异丙醇混匀，在4℃条件下用转速12000 r/min离心5 min;弃上清液，加入70%的乙醇洗涤沉淀，自然晾干，用100 μL含RNA酶A（20 mg/mL）的TE溶解DNA，于-20℃条件下冷冻保存备用。
2.2.4 食品样品前处理和模板DNA的提取 （1）样品处理：无菌条件下取25 g或25 mL食品样品，放入225 mL灭菌生理盐水中均质，制成10倍梯度稀释液。（2）增菌培养：将菌液接入7.5% NaCl肉汤或胰蛋白胨肉汤中，37℃振荡培养半小时。（3）取菌液4℃条件下4000 r/min离心10 min，取上清液加入另一灭菌离心管中以10000 rpm离心20 min，沉淀依据细菌基因组DNA提取步骤进行提取，利用已经建立的PCR反应程序进行检测。取PCR产物在琼脂糖凝胶上进行电泳，利用凝膠成像系统观察结果。
2.2.5 灵敏度及特异性分析 将致病微生物培养增菌后接种于食品样品中，培养后计数，将已测浓度的菌液用生理盐水稀释，得到稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍的稀释液，取2 mL提取DNA，以各自提取DNA为模板进行PCR检测。
3 结果与分析
3.1 PCR反应条件的优化
PCR退火温度优化结果，为了选择最佳的退火温度，参照查阅的文献，分别选择47.3 ℃、48.4℃、50.0℃、51.7 ℃、53.3℃、54℃进行多重PCR扩增，结果如图1所示。随着退火温度的升高，条带有明显变亮的趋势，但到53.3℃时已变化不大，因此确定53.3 ℃为多重PCR的最佳的退火温度。
3.2 人工污染样品的检测
按照2.2.4的方法将食品进行处理，并提取检测样品的DNA，将提取的冻肉中的DNA进行PCR扩增。观察结果如图2所示，图中出现所需菌种的扩增的特异性条带，并且条带清晰明亮，表明食品中存在大肠杆菌存在，并能成功扩增出结果。 3.3 样品PCR灵敏度检测
将大肠杆菌人工感染冻肉处理液，经培养直接提取DNA，以DNA为模板，进行10倍梯度稀释然后进行PCR检测，从图3可以看出大肠杆菌的最低检测限为2×10-4 ng/μL。
4 结论与讨论
根据本试验的结果表明，选择大肠杆菌的编码溶血素基因（hlyA）作为目的基因设计的特异性引物，引物的特异性较强且互不干扰，可以用于PCR检测大肠杆菌。在PCR反应体系的退火温度的条件优化中确立了53.3℃是最优的退火温度。在冻肉的检测样品中大肠杆菌的最低检测含量为2×10-4ng/μL。本研究在冻肉中检出大肠杆菌具有较强特异性。
本研究中特异性引物的设计存在些问题，在PCR的大肠杆菌的阴性对照中，存在一条不是预估的条带，但是并不影响大肠杆菌的鉴定。所以特异性目的基因的选择显得尤为重要，本试验对大肠杆菌的灵敏度最低检测限较低，通过讨论分析：影响因素大致分为两个，一是检测样品的基因组DNA浓度与含量较低，二是冻肉中脂肪和蛋白质的含量较多，介质成分干扰PCR结果。但大多数的肉制品的致病菌的感染剂量均大于103CFU/ml[8]。所以本试验的灵敏度检测结果对实际的应用具有参考意义。
本试验建立了冻肉中大肠
杆菌的PCR检测方法，大大缩短了检验时间与检验成本。检测出冻肉中的两种致病菌具有很高的特异性、较高的灵敏度、成本低的特点，与实验室中传统的食品中致病菌的检测相比，极大的节省时间，在食品安全检测中具有一定实际应用价值。
参考文献：
[1] 刘秀英，胡怡秀. 全球食源性疾病现状[J].国外医学： 卫生
学分册，2003， 30（4）： 199-205.
[2] 徐君飞，张居作. 2001—2010年中国食源性疾病暴发情况
分析[J]. 中国农学通报， 2012， 28（27）： 313-316.
[3] LI M Y，