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摘要建立了毛细管区带电泳法测定医药污水中氯霉素（CAP）含量的方法。供试品经离子化处理后用0.22μm微孔滤膜过滤，并用毛细管电泳仪直接对续滤液进行测定；方法采用磷酸盐缓冲液（10 mmol/L，用0.2 mol/L氢氧化钠溶液调节缓冲溶液pH值至6.0）作为分离缓冲液，未涂层毛细管柱（65 cm×75μm，有效长度56 cm）作为分离柱，柱温25℃，分离电压25 KV，50 mbar压力下进样10s，检测波长为268 nm。结果表明：氯霉素平均回收率为98.1%（n=9），在5μg/mL～200μg/mL浓度范围内呈良好的线性关系（r≥0.9991），检出限≤0.2μg/mL（S/N=3）。应用此方法对6份供试品进行检测，有1份检出氯霉素，其他各供试品均未检出。此方法简便、准确且可靠，用于医药污水中氯霉素的测定，结果满意。
关键词毛细管区带电泳医药污水氯霉素
氯霉素属于广谱抑菌抗生素，是治疗伤寒、副伤寒的首选药，治疗厌氧菌感染的特效药物之一。但氯霉素可造成骨髓造血机能紊乱，导致严重的再生障碍性贫血、粒状白细胞缺乏症等疾病，甚至引起可“灰婴综合征”。因此，监测环境中残留的氯霉素尤为重要。
目前，氯霉素的检测方法主要有微生物法、酶联免疫法、薄层色谱法、液相色谱法、液质联用法等。但这些方法均操作繁琐，涉及耗材价格昂贵，需消耗大量有毒有害试剂。毛细管电泳法是近年发展非常迅速的检测手段，具有排放低、环境污染小、检测成本低廉、样品处理简单快速、分析周期短等诸多优势。研究建立的方法兼具以上优势，准确且可靠，为医药污水中氯霉素的检测提供了经济高效的方法，同时为我国其他抗生素废水的综合治理，提供可借鉴的新思路和新方法。
一、实验部分
1.仪器与试药。7100高效毛细管电泳仪（美国Agilent公司，配备DAD检测器），超纯水仪（美国Millipore公司），pH计（瑞士Mettler-Toledo公司），针筒滤头（0.22μm，日本岛津公司），玻璃微孔滤膜过滤器（北京鸿苑鑫仪科技有限公司），未涂层的弹性石英毛细管柱（65 cm×50μm，有效长度56 cm，美国Agilent公司）。
氯霉素对照品购自中国食品药品检定研究院。甲醇（色谱纯）购自Fisher公司，氢氧化钠（分析纯）、磷酸（分析纯）、磷酸二氢钠（分析纯）购自西安化学试剂厂，醋酸钠（分析纯）、硼砂（优级纯）购自北联精细化学品开发有限公司。
2.方法。（1）仪器参数。配制10 mmol/L的磷酸盐缓冲液，用0.2 mol/L氢氧化钠溶液调节缓冲溶液pH值至6.0作为分离缓冲溶液；分离电压为25 KV，柱温为25℃，采集波长268 nm，压力进样（50 mbar，10 s）。
（2）对照品溶液与供试品溶液的制备。精密称取氯霉素对照品25 mg，置25 mL容量瓶中，加5 mL甲醇使溶解，用分离缓冲液稀释至刻度作为对照品储备溶液。取储备溶液1 mL加分离缓冲液稀释至50 mL作为对照品溶液。
称取适量磷酸二氢钠，加污水制成10 mol/L的磷酸盐溶液，并用0.2 mol/L的氢氧化钠溶液调节各溶液pH值至6.0，经0.22μm微孔滤膜过滤后作为供试品溶液。
二、结果与讨论
1.电泳条件的确定。
（1）缓冲体系pH值的选择。氯霉素的等电点（pI）为7.5，分离缓冲体系的最佳pH值应为6.5～8.5。配制20 mmol/L的磷酸二氢钠溶液，用0.2 mol/L的氢氧化钠溶液分别调节pH值至6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5进行测定。结果显示：随着缓冲液pH值的增加，氯霉素迁移时间缩短，柱效升高，但碱性环境下氯霉素会迅速降解，因此，研究选择pH值为6.0的缓冲体系进行测定。缓冲体系pH值与各组分迁移时间的关系详见图1。
（2）缓冲体系及浓度的选择。配制硼砂溶液（40 mmol/L）、醋酸钠溶液（20 mmol/L）、磷酸二氢钠（20 mmol/L）溶液，并用0.2 mol/L磷酸溶液、0.2 mol/L氢氧化钠溶液分别调节各溶液pH值至6.0进行测定，结果显示磷酸盐体系和硼酸盐体系均呈现良好的测定效果。考虑到硼酸盐对人体危害较大，因此实验采用磷酸盐体系进行测定。
分别配制5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L、40 mmol/L的磷酸盐溶液，用0.2 mol/L氢氧化钠溶液调节磷酸盐溶液pH值至6.0进行测定。结果表明，随着磷酸盐浓度增加，电渗流减小，迁移时间延长；当磷酸盐浓度过小时，供试品液中氯霉素基质干扰严重，而浓度较大时，焦耳热明显增加。缓冲体系浓度与氯霉素迁移时间的关系详见图2。综合考虑，研究选取10 mmol/L磷酸盐溶液进行测定。
（3）进样时间的选择。研究考查了进样时间对测定的影响。结果表明，待测组分峰高、峰面积和峰宽均随进样时间的增加而增加，同时柱效降低；进样时间过长分离柱表现出过载现象，进样时间过短则会影响方法的灵敏度，因此研究选用的进样时间为10S。
（4）分离电压的选择。将分离电压分别设置为15 kV、20 kV、25 kV、30 kV进行测定。结果显示，随着分离电压的升高，电流亦随之升高，待测组分迁移时间缩短，但焦耳热明显增加。综合考虑，研究选取25 kV作为分离电压。
在上述最佳分离条件下测定对照品溶液，得到电泳图见图3。
2.方法验证。
（1）线性范围。向1号供试品中添加适量对照品溶液，制成待测组分质量浓度分别为5μg/ml，20μg/ml，40μg/ml，80μg/ml，150μg/m、200μg/ml的梯度溶液进行测定，图4为1号供试品及其加标后的电泳图。
以待测组分的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制工作曲线。结果表明：氯霉素在5μg/ml～200μg/ml浓度范围内峰面积与浓度线性关系良好，且未见明显的干扰峰。回归方程见表1。
（2）检出限和回收率。向1号供试品中添加适量对照品溶液，制成待测组分质量浓度分别为10μg/ml、80μg/ml、150μg/ml的溶液，每个加标浓度各3份，在最佳条件下进行测定，计算CAP的平均回收率（n=9）；同法测定方法检出限，调节溶液中各组分浓度使信噪比为3，计算CAP的检出限（S/N=3），结果见表1。
3.供试品的测定。供试品来源不同，基质影响也不同。为此，方法采用DAD检测器对供试品中各组分峰进行紫外光谱扫描（190 nm～400 nm），再与对照品峰的紫外光谱图进行比对，并根据光谱纯度阈值判定是否存在基质干扰，有效避免了假阳性结果的出现。
随机选取乌市某街道社区卫生服务站1家、医院配液中心2家、医院制剂室1家，制药厂2家，在其工作场所的污水排放口量取适量污水，按1.2.2处理后进行测定，结果见表2。图5为4号阳性检出供试品的毛细管电泳图。
三、结论
研究建立的方法丰富了医药污水中氯霉素的检测手段，考察了分离缓冲液组成、pH值、分离电压等因素对CAP测定的影响。该方法回收率及检出限均能满足一般分析要求；采用DAD检测器作为辅助定性手段能有效避免假阳性结果出现，并能用于分析基质的干扰。该方法具有成本低廉，样品处理简单，污染物排放低等优点，用于废水中氯霉素的测定，结果令人满意；同时方法也可用于其他类型样品中氯霉素的测定。
参考文献
[1]李荣誉，刘永录.动物性食品兽药残留及其对人体的危害[J].中国兽医杂志，2010，46（12）：74-76.
[2]朱蓓蕾.动物性食品药物残留[M].上海：上海科学技术出版社，1994：70-71.
[3]宋杰，宋燕青，王勇鑫，赵宝华.微生物法在检测牛奶中氯霉素残留的应用[J].河北师范大学学报（自然科学版），2005，29（1）：85-87.
[4]王铁军，狄永平.氯霉素制剂标准中含量测定应采用微生物检定法[J].中国医药导报2007，4（12）：166-168.
[5]陈霞，杨晓霞，骆朋辉，骆鹏杰.高灵敏度酶联免疫法快速检测动物源性产品中氯霉素残留的研究[J].中国畜牧兽医，2013，6：233-236.
[6]贾涛.酶联免疫法检测饲料中氯霉素的方法条件研究[J].饲料与畜牧（新饲料）2013，8：43-47.
[7]莫金娜，温玉莹.薄层色谱法检测化妆品中的氯霉素[J].中国卫生检验杂志，2008，18（9）：1767-1769.
[8]胡娟妮，聂平，邓永琪，李晓燕，李文莉.高效液相色谱法测定氯锌油中氯霉素含量[J].中国药业，2014，23（4）：44-45.
[9]夏晓梅，豁银强，汤尚文.高效液相色谱法检测牛奶中氯霉素残留[J].现代农业科技，2015，1：294-298.
[10]姚佳，王昕，张建新，李贤良，郗存显，王国民，王雄，里南，果旗.免疫亲和柱-高效液相色谱法测定牛奶中氯霉素和玉米赤霉醇及其类似物[J].食品科学，2014，35（18）：124-127.
[11]王硕，张晶，邵兵.超高效液相色谱-串联质谱测定污泥中氯霉素、磺胺类、喹诺酮类、四环素类与大环内酯类抗生素[J].分析测试学报，2013，32（2）：179-185.
[12]张晓燕，张睿，许蔚，黄娟，刘艳，吴斌，陈磊，丁涛，沈崇钰，陈惠兰.高效液相色谱-串联质谱法测定蜂胶中的氯霉素[J].色谱，2012，30（3）：314-317.
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关键词毛细管区带电泳医药污水氯霉素
氯霉素属于广谱抑菌抗生素，是治疗伤寒、副伤寒的首选药，治疗厌氧菌感染的特效药物之一。但氯霉素可造成骨髓造血机能紊乱，导致严重的再生障碍性贫血、粒状白细胞缺乏症等疾病，甚至引起可“灰婴综合征”。因此，监测环境中残留的氯霉素尤为重要。
目前，氯霉素的检测方法主要有微生物法、酶联免疫法、薄层色谱法、液相色谱法、液质联用法等。但这些方法均操作繁琐，涉及耗材价格昂贵，需消耗大量有毒有害试剂。毛细管电泳法是近年发展非常迅速的检测手段，具有排放低、环境污染小、检测成本低廉、样品处理简单快速、分析周期短等诸多优势。研究建立的方法兼具以上优势，准确且可靠，为医药污水中氯霉素的检测提供了经济高效的方法，同时为我国其他抗生素废水的综合治理，提供可借鉴的新思路和新方法。
一、实验部分
1.仪器与试药。7100高效毛细管电泳仪（美国Agilent公司，配备DAD检测器），超纯水仪（美国Millipore公司），pH计（瑞士Mettler-Toledo公司），针筒滤头（0.22μm，日本岛津公司），玻璃微孔滤膜过滤器（北京鸿苑鑫仪科技有限公司），未涂层的弹性石英毛细管柱（65 cm×50μm，有效长度56 cm，美国Agilent公司）。
氯霉素对照品购自中国食品药品检定研究院。甲醇（色谱纯）购自Fisher公司，氢氧化钠（分析纯）、磷酸（分析纯）、磷酸二氢钠（分析纯）购自西安化学试剂厂，醋酸钠（分析纯）、硼砂（优级纯）购自北联精细化学品开发有限公司。
2.方法。（1）仪器参数。配制10 mmol/L的磷酸盐缓冲液，用0.2 mol/L氢氧化钠溶液调节缓冲溶液pH值至6.0作为分离缓冲溶液；分离电压为25 KV，柱温为25℃，采集波长268 nm，压力进样（50 mbar，10 s）。
（2）对照品溶液与供试品溶液的制备。精密称取氯霉素对照品25 mg，置25 mL容量瓶中，加5 mL甲醇使溶解，用分离缓冲液稀释至刻度作为对照品储备溶液。取储备溶液1 mL加分离缓冲液稀释至50 mL作为对照品溶液。
称取适量磷酸二氢钠，加污水制成10 mol/L的磷酸盐溶液，并用0.2 mol/L的氢氧化钠溶液调节各溶液pH值至6.0，经0.22μm微孔滤膜过滤后作为供试品溶液。
二、结果与讨论
1.电泳条件的确定。
（1）缓冲体系pH值的选择。氯霉素的等电点（pI）为7.5，分离缓冲体系的最佳pH值应为6.5～8.5。配制20 mmol/L的磷酸二氢钠溶液，用0.2 mol/L的氢氧化钠溶液分别调节pH值至6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5进行测定。结果显示：随着缓冲液pH值的增加，氯霉素迁移时间缩短，柱效升高，但碱性环境下氯霉素会迅速降解，因此，研究选择pH值为6.0的缓冲体系进行测定。缓冲体系pH值与各组分迁移时间的关系详见图1。
（2）缓冲体系及浓度的选择。配制硼砂溶液（40 mmol/L）、醋酸钠溶液（20 mmol/L）、磷酸二氢钠（20 mmol/L）溶液，并用0.2 mol/L磷酸溶液、0.2 mol/L氢氧化钠溶液分别调节各溶液pH值至6.0进行测定，结果显示磷酸盐体系和硼酸盐体系均呈现良好的测定效果。考虑到硼酸盐对人体危害较大，因此实验采用磷酸盐体系进行测定。
分别配制5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L、40 mmol/L的磷酸盐溶液，用0.2 mol/L氢氧化钠溶液调节磷酸盐溶液pH值至6.0进行测定。结果表明，随着磷酸盐浓度增加，电渗流减小，迁移时间延长；当磷酸盐浓度过小时，供试品液中氯霉素基质干扰严重，而浓度较大时，焦耳热明显增加。缓冲体系浓度与氯霉素迁移时间的关系详见图2。综合考虑，研究选取10 mmol/L磷酸盐溶液进行测定。
（3）进样时间的选择。研究考查了进样时间对测定的影响。结果表明，待测组分峰高、峰面积和峰宽均随进样时间的增加而增加，同时柱效降低；进样时间过长分离柱表现出过载现象，进样时间过短则会影响方法的灵敏度，因此研究选用的进样时间为10S。
（4）分离电压的选择。将分离电压分别设置为15 kV、20 kV、25 kV、30 kV进行测定。结果显示，随着分离电压的升高，电流亦随之升高，待测组分迁移时间缩短，但焦耳热明显增加。综合考虑，研究选取25 kV作为分离电压。
在上述最佳分离条件下测定对照品溶液，得到电泳图见图3。
2.方法验证。
（1）线性范围。向1号供试品中添加适量对照品溶液，制成待测组分质量浓度分别为5μg/ml，20μg/ml，40μg/ml，80μg/ml，150μg/m、200μg/ml的梯度溶液进行测定，图4为1号供试品及其加标后的电泳图。
以待测组分的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制工作曲线。结果表明：氯霉素在5μg/ml～200μg/ml浓度范围内峰面积与浓度线性关系良好，且未见明显的干扰峰。回归方程见表1。
（2）检出限和回收率。向1号供试品中添加适量对照品溶液，制成待测组分质量浓度分别为10μg/ml、80μg/ml、150μg/ml的溶液，每个加标浓度各3份，在最佳条件下进行测定，计算CAP的平均回收率（n=9）；同法测定方法检出限，调节溶液中各组分浓度使信噪比为3，计算CAP的检出限（S/N=3），结果见表1。
3.供试品的测定。供试品来源不同，基质影响也不同。为此，方法采用DAD检测器对供试品中各组分峰进行紫外光谱扫描（190 nm～400 nm），再与对照品峰的紫外光谱图进行比对，并根据光谱纯度阈值判定是否存在基质干扰，有效避免了假阳性结果的出现。
随机选取乌市某街道社区卫生服务站1家、医院配液中心2家、医院制剂室1家，制药厂2家，在其工作场所的污水排放口量取适量污水，按1.2.2处理后进行测定，结果见表2。图5为4号阳性检出供试品的毛细管电泳图。
三、结论
研究建立的方法丰富了医药污水中氯霉素的检测手段，考察了分离缓冲液组成、pH值、分离电压等因素对CAP测定的影响。该方法回收率及检出限均能满足一般分析要求；采用DAD检测器作为辅助定性手段能有效避免假阳性结果出现，并能用于分析基质的干扰。该方法具有成本低廉，样品处理简单，污染物排放低等优点，用于废水中氯霉素的测定，结果令人满意；同时方法也可用于其他类型样品中氯霉素的测定。
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[9]夏晓梅，豁银强，汤尚文.高效液相色谱法检测牛奶中氯霉素残留[J].现代农业科技，2015，1：294-298.
[10]姚佳，王昕，张建新，李贤良，郗存显，王国民，王雄，里南，果旗.免疫亲和柱-高效液相色谱法测定牛奶中氯霉素和玉米赤霉醇及其类似物[J].食品科学，2014，35（18）：124-127.
[11]王硕，张晶，邵兵.超高效液相色谱-串联质谱测定污泥中氯霉素、磺胺类、喹诺酮类、四环素类与大环内酯类抗生素[J].分析测试学报，2013，32（2）：179-185.
[12]张晓燕，张睿，许蔚，黄娟，刘艳，吴斌，陈磊，丁涛，沈崇钰，陈惠兰.高效液相色谱-串联质谱法测定蜂胶中的氯霉素[J].色谱，2012，30（3）：314-317.
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