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[摘 要] 目的：对类风湿性关节炎患者血清抗环瓜氨酸肽（CCP）、角质蛋白抗体（AKA）和类风湿因子（RF）进行检测，并对这些抗体间相关性进行探讨。方法：采用酶免疫法检测抗环瓜氨酸肽抗体；间接免疫荧光法（IIF）检测AKA；采用乳胶凝集法检测RF；采用卡方检验对结果进行统计学比较。结果：RA患者血清中抗CCP阳性率83.3%（75/90），AKA（1∶10）阳性率44.4%（40/90），RF（1∶20）阳性率66.7%（60/90）。结论：虽然RA患者血清中可出现上述三种抗体，但AKA与抗CCP、AKA与RF之间无相关性，而抗CCP与RF之间有相关性。
[关键词] 类风湿关节炎；抗环瓜氨酸肽；角质蛋白抗体；类风湿因子
Discussion on Correlation between Cyclic Citrullinated Peptid, Antikeratin antibody, and Rheumatoid Factor in Patients with Rheumatoid Arthritis
CHEN Ji-cai,LIN Qiu-qiang,CHEN Ren,et al.
(The People’s Hospital of Chenghai,Chenghai, Guangdong Province, Chenghai 515800,China)
[Abstract] Objective： Subjectiue This study is to detect the cyclic citrullinated peptid(CCP), antikeratin antibody(AKA), and rheumatoid factor(RF)of the serum of patients with rheumatoid arthritis, and to discuss the correlation between these three antibodies. Methods： The study applied the enzyme immunoassay for the detection of cyclic citrullinated peptid(CCP); applied the indirect immunofluorescence(IIF)for the detection of antikeratin antibody(AKA); applied the latex agglutination for the detection of rheumatoid factor(RF); and applied the chi square test to statistically compare these results.Results ：The positive rate of cyclic citrullinated peptid(CCP)of the serum of patients with rheumatoid arthritis was 83.3%(75/90), the positive rate of antikeratin antibody(1:10)was 44.4%(40/90), and the positive rate of rheumatoid factor(1:20)was 66.7%(60/90).Conclusion ：That although the three above-mentioned antibodies could be found in the serum of patients with rheumatoid arthritis, there was no correlation between antikeratin antibody(AKA)and the other antibodies, while there was correlation between cyclic citrullinated peptid(CCP)and rheumatoid factor(RF).
[Key Words] Rheumatoid arthritis; Cyclic citrullinated peptid; Antikeratin antibody; Rheumatoid factor
类风湿关节炎（RheumatoidArthritis，RA）诊断标准以前主要依靠临床表现、Х线检查以及类风湿因子（Rheumatoid Factor RF）检测，当影像学出现改变时，骨质已出现破坏，而RF又缺乏特异性，以上诊断标准不利于RA早期诊断。近年来，研究较多的对RA的诊断有几种自身抗体的检测，如抗核周因子（Antiperinuclear factor，APF）、抗角质蛋白（Antikeratin antibody，AKA）及抗聚角蛋白微丝蛋白（Anti-filaggrin antibody，AFA）、抗Sa抗体以及抗环瓜氨酸肽（Cyclic citrullinated peptid CCP）均有较高的特异性。目前对抗CCP和AKA的研究主要集中在对RA的诊断价值的研究，对抗CCP、AKA和RF三者之间的相关性并未进行深入的研究。为探讨抗CCP、AKA、RF三者之间的关系及对RA诊断的临床意义，本研究不仅对RA患者血清内抗CCP、AKA和RF进行检测，并对三者之间的相关性进行探讨。
1 资料与方法
1.1 RA患者组 共90例，为我院风湿科就珍的患者，诊断符合1987年ARARA分类标准，其中女71例，男19例，年龄最大74岁，最小25岁，平均51岁。
1.2 方法
1.2.1 抗CCP（第二代）和AKA购自德国欧蒙实验诊断试剂有限公司，采用酶免疫法检测抗CCP抗体，间接免疫荧光法检测角质蛋白抗体，严格按照试剂说明书进行操作检测。 1.2.2 RF检测：试剂购自上海捷门生物试剂有限公司产品，严格按照说明书操作。
2 结果
2.1 抗CCP结果判定 抗CCP抗体浓度大于10RU/ml作为诊断标准，共有75例阳性，阳性率为83.3%（75/90）。5～10 RU/ml为可疑，追综观察。见表1。
2.2 AKA结果判定 血清作1∶10稀释，在角质层出现点片状或板层状绿色荧光判为阳性，共有40例阳性，阳性率为44.4%（40/90）。
2.3 RF结果判定 血清作1∶20稀释，出现肉眼可见颗粒凝集判为阳性，共有60例阳性，阳性率为66.7%（60/90）。
表1 抗CCP、AKA和RF的相关性比较
3 讨论
1979 young等人从wistar大鼠食管中1/3冰冻切片为底物，采用间接免疫荧光法（indirect immunofluosence，IIF）在RA患者血清中发现了一种能与鼠食管角质层反应的抗体，将其称为角质蛋白抗体，即为AKA，并认为它对RA的诊断具有较高的特异性[1]。其后许多学者进行了研究，因其抗原制备和保存方法不同，阳性结果判断标准不一致，使其抗本的敏感性和特异性差别很大。1989年vincent提出IIF检测AKA操作规范及以角质层线状或板层状荧光为阳性判断标准以来，文献报道IIF法检测AKA的特异性明显提高。用IIF检测RA患者AKA的敏感度和特异性分别为36%～59%和88%～99%[2]。本研究AKA检测采用标准试剂盒，对RA患者检测的灵敏度达到44.4%，与文献报道相符。进一步的临床研究发现，AKA阳性患者常表现为ESR增快，CRP增高，循环免疫复合物增多，所伴发的关节外表现较多，预后较AKA阴性者差，并认为AKA是判断RA预后的指标之一。在临床研究还发现，对AKA（40/90）阳性RA患者的随访研究发现，当病情活动时，AKA和CRP增高，当病情缓解时AKA和CRP随之下降；与RA的病情严重程度和疾病活动相关[3，4]。本研究还对AKA阳性而RF阴性的健康人进行追踪观察，最后有一部分人发展为典型的RA，与RF因子在RA患者血清出现之间无相关性。因此，AKA可能是RA早期诊断指标之一[4]。
已有的研究表明：AKA的靶抗原为丝集蛋白，而丝集蛋白与前丝集蛋白相比，丝集蛋白具有更多的瓜氨酸位点，且检测敏感性要高于前丝集蛋白。CCP正是依据AKA抗原位点的特性，在体外合成的一种人工抗原。由于该抗原具备了多个瓜氨酸位点，因此敏感度得到了明显提升而特异性保持不变。2000年Schellekens合成环瓜氨酸肽（CCP），用环瓜氨酸肽为抗原基质，用ELISA法检测RA患者血清中的抗CCP，并证实抗CCP抗体对RA具有很高的敏感性和特异性。但抗CCP在RA患者中检测的灵敏度各家报道不一，本研究采用标准化抗CCP第二代试剂盒，在RA患者中检测的灵敏度为83.3%，与胡学芳报道相符[5]。本研究还发现，在RA患者抗CCP的动态观察研究中，没有发现RA患者抗CCP阳性转为阴性，也没有发现RA患者抗CCP阴性转为阳性，说明RA患者关节慢性侵蚀性损害与抗CCP长期存在有关。Bas等[6]也报道CCP抗体与RA骨侵蚀具有相关性。现有的研究表明，AKA针对的抗原是天然丝集蛋白，而丝集蛋白的确具有多个瓜氨酸位点，同时还具备多个精氨酸位点。AKA抗体所结合的抗原位点并不仅仅局限于瓜氨酸化的位点，而是整个分子所形成的位点。也就是说，瓜氨酸化位点只是抗体与抗原结合的其中一个要素。CCP是针对丝集蛋白在体内表达的特点，在体外人工合成的瓜氨酸多肽。抗CCP抗体同样并不是仅仅局限于与瓜氨酸位点相结合，而是与整个CCP分子所构成的抗原位点相结合。而且CCP是人工合成的抗原，而AKA抗原为天然抗原。所以，AKA与抗CCP的抗原位点不完全重叠，本研究也证实了这一点，资料经统计学分析，P>0.05。因此，AKA与抗CCP在RA患者血清出现之间也无相关性。
而在分析抗CCP与RF时，两者之间一致率为65.6%（59/90），资料经统计学分析，P<0.05。因此，抗CCP与RF在RA患者血清出现之间有关性。
虽然人们先后发现了上述三种自身抗体，对三者之间主要集中在对RA的诊断价值研究，但对三者之间的相关性并未进行深入的研究。一般认为，AKA与疾病的严重程度及活动性相关，可用于对患者病情及预后的判断；而抗CCP与骨关节侵蚀密切相关，可用于对骨关节破坏严重程度的判断，并由于其检测灵敏度高，可作为对RA早期诊断；RF虽然不具有对RA诊断特异性，但其效价在判断预后上有重要作用。本研究表明，虽然RA患者血清中可出现上述三种自身抗体，但AKA与RF，AKA与抗CCP的出现无明显相关性，而抗CCP与RF之间的出现有相关性。在研究中我们还发现，在一个患者中可检测出一种、二种抗体，甚至可同时出现上述三种抗体，但也有一部分患者体内检测不出上述任何抗体，这一部分患者预后有待进一步的追踪研究。
参考文献：
[1] Youg B J J，M alya RK，leslie RDG，et al.Antrkeratin antibodies inrheum atoid arth ritis.BM J，1979，2：97-99.
[2] 范列英.类风湿性关节炎血清早期诊断指标的研究进展.中华医学检验杂志，2003，26（10）632-634.
[3] Vincent C et al. Ann Rheum Dis， 1989，48：712-722.
[4] Paimela L et al.Ann Rheum Dis，1992，51：743-746.
[5] 胡学芳，魏华，朱爱萍，等.抗环瓜氨酸肽抗体检测在类风湿关节炎诊断中的临床意义.中华检验医学杂志，2003，26（8）：489-487.
[6] Bas S， perneger TY.Diagnostic tests forrherum a to idarthritis：comparison of antibodies and IgM rheum a to id factorsRheum a to logy，2002，41（7）：809.
[关键词] 类风湿关节炎；抗环瓜氨酸肽；角质蛋白抗体；类风湿因子
Discussion on Correlation between Cyclic Citrullinated Peptid, Antikeratin antibody, and Rheumatoid Factor in Patients with Rheumatoid Arthritis
CHEN Ji-cai,LIN Qiu-qiang,CHEN Ren,et al.
(The People’s Hospital of Chenghai,Chenghai, Guangdong Province, Chenghai 515800,China)
[Abstract] Objective： Subjectiue This study is to detect the cyclic citrullinated peptid(CCP), antikeratin antibody(AKA), and rheumatoid factor(RF)of the serum of patients with rheumatoid arthritis, and to discuss the correlation between these three antibodies. Methods： The study applied the enzyme immunoassay for the detection of cyclic citrullinated peptid(CCP); applied the indirect immunofluorescence(IIF)for the detection of antikeratin antibody(AKA); applied the latex agglutination for the detection of rheumatoid factor(RF); and applied the chi square test to statistically compare these results.Results ：The positive rate of cyclic citrullinated peptid(CCP)of the serum of patients with rheumatoid arthritis was 83.3%(75/90), the positive rate of antikeratin antibody(1:10)was 44.4%(40/90), and the positive rate of rheumatoid factor(1:20)was 66.7%(60/90).Conclusion ：That although the three above-mentioned antibodies could be found in the serum of patients with rheumatoid arthritis, there was no correlation between antikeratin antibody(AKA)and the other antibodies, while there was correlation between cyclic citrullinated peptid(CCP)and rheumatoid factor(RF).
[Key Words] Rheumatoid arthritis; Cyclic citrullinated peptid; Antikeratin antibody; Rheumatoid factor
类风湿关节炎（RheumatoidArthritis，RA）诊断标准以前主要依靠临床表现、Х线检查以及类风湿因子（Rheumatoid Factor RF）检测，当影像学出现改变时，骨质已出现破坏，而RF又缺乏特异性，以上诊断标准不利于RA早期诊断。近年来，研究较多的对RA的诊断有几种自身抗体的检测，如抗核周因子（Antiperinuclear factor，APF）、抗角质蛋白（Antikeratin antibody，AKA）及抗聚角蛋白微丝蛋白（Anti-filaggrin antibody，AFA）、抗Sa抗体以及抗环瓜氨酸肽（Cyclic citrullinated peptid CCP）均有较高的特异性。目前对抗CCP和AKA的研究主要集中在对RA的诊断价值的研究，对抗CCP、AKA和RF三者之间的相关性并未进行深入的研究。为探讨抗CCP、AKA、RF三者之间的关系及对RA诊断的临床意义，本研究不仅对RA患者血清内抗CCP、AKA和RF进行检测，并对三者之间的相关性进行探讨。
1 资料与方法
1.1 RA患者组 共90例，为我院风湿科就珍的患者，诊断符合1987年ARARA分类标准，其中女71例，男19例，年龄最大74岁，最小25岁，平均51岁。
1.2 方法
1.2.1 抗CCP（第二代）和AKA购自德国欧蒙实验诊断试剂有限公司，采用酶免疫法检测抗CCP抗体，间接免疫荧光法检测角质蛋白抗体，严格按照试剂说明书进行操作检测。 1.2.2 RF检测：试剂购自上海捷门生物试剂有限公司产品，严格按照说明书操作。
2 结果
2.1 抗CCP结果判定 抗CCP抗体浓度大于10RU/ml作为诊断标准，共有75例阳性，阳性率为83.3%（75/90）。5～10 RU/ml为可疑，追综观察。见表1。
2.2 AKA结果判定 血清作1∶10稀释，在角质层出现点片状或板层状绿色荧光判为阳性，共有40例阳性，阳性率为44.4%（40/90）。
2.3 RF结果判定 血清作1∶20稀释，出现肉眼可见颗粒凝集判为阳性，共有60例阳性，阳性率为66.7%（60/90）。
表1 抗CCP、AKA和RF的相关性比较
3 讨论
1979 young等人从wistar大鼠食管中1/3冰冻切片为底物，采用间接免疫荧光法（indirect immunofluosence，IIF）在RA患者血清中发现了一种能与鼠食管角质层反应的抗体，将其称为角质蛋白抗体，即为AKA，并认为它对RA的诊断具有较高的特异性[1]。其后许多学者进行了研究，因其抗原制备和保存方法不同，阳性结果判断标准不一致，使其抗本的敏感性和特异性差别很大。1989年vincent提出IIF检测AKA操作规范及以角质层线状或板层状荧光为阳性判断标准以来，文献报道IIF法检测AKA的特异性明显提高。用IIF检测RA患者AKA的敏感度和特异性分别为36%～59%和88%～99%[2]。本研究AKA检测采用标准试剂盒，对RA患者检测的灵敏度达到44.4%，与文献报道相符。进一步的临床研究发现，AKA阳性患者常表现为ESR增快，CRP增高，循环免疫复合物增多，所伴发的关节外表现较多，预后较AKA阴性者差，并认为AKA是判断RA预后的指标之一。在临床研究还发现，对AKA（40/90）阳性RA患者的随访研究发现，当病情活动时，AKA和CRP增高，当病情缓解时AKA和CRP随之下降；与RA的病情严重程度和疾病活动相关[3，4]。本研究还对AKA阳性而RF阴性的健康人进行追踪观察，最后有一部分人发展为典型的RA，与RF因子在RA患者血清出现之间无相关性。因此，AKA可能是RA早期诊断指标之一[4]。
已有的研究表明：AKA的靶抗原为丝集蛋白，而丝集蛋白与前丝集蛋白相比，丝集蛋白具有更多的瓜氨酸位点，且检测敏感性要高于前丝集蛋白。CCP正是依据AKA抗原位点的特性，在体外合成的一种人工抗原。由于该抗原具备了多个瓜氨酸位点，因此敏感度得到了明显提升而特异性保持不变。2000年Schellekens合成环瓜氨酸肽（CCP），用环瓜氨酸肽为抗原基质，用ELISA法检测RA患者血清中的抗CCP，并证实抗CCP抗体对RA具有很高的敏感性和特异性。但抗CCP在RA患者中检测的灵敏度各家报道不一，本研究采用标准化抗CCP第二代试剂盒，在RA患者中检测的灵敏度为83.3%，与胡学芳报道相符[5]。本研究还发现，在RA患者抗CCP的动态观察研究中，没有发现RA患者抗CCP阳性转为阴性，也没有发现RA患者抗CCP阴性转为阳性，说明RA患者关节慢性侵蚀性损害与抗CCP长期存在有关。Bas等[6]也报道CCP抗体与RA骨侵蚀具有相关性。现有的研究表明，AKA针对的抗原是天然丝集蛋白，而丝集蛋白的确具有多个瓜氨酸位点，同时还具备多个精氨酸位点。AKA抗体所结合的抗原位点并不仅仅局限于瓜氨酸化的位点，而是整个分子所形成的位点。也就是说，瓜氨酸化位点只是抗体与抗原结合的其中一个要素。CCP是针对丝集蛋白在体内表达的特点，在体外人工合成的瓜氨酸多肽。抗CCP抗体同样并不是仅仅局限于与瓜氨酸位点相结合，而是与整个CCP分子所构成的抗原位点相结合。而且CCP是人工合成的抗原，而AKA抗原为天然抗原。所以，AKA与抗CCP的抗原位点不完全重叠，本研究也证实了这一点，资料经统计学分析，P>0.05。因此，AKA与抗CCP在RA患者血清出现之间也无相关性。
而在分析抗CCP与RF时，两者之间一致率为65.6%（59/90），资料经统计学分析，P<0.05。因此，抗CCP与RF在RA患者血清出现之间有关性。
虽然人们先后发现了上述三种自身抗体，对三者之间主要集中在对RA的诊断价值研究，但对三者之间的相关性并未进行深入的研究。一般认为，AKA与疾病的严重程度及活动性相关，可用于对患者病情及预后的判断；而抗CCP与骨关节侵蚀密切相关，可用于对骨关节破坏严重程度的判断，并由于其检测灵敏度高，可作为对RA早期诊断；RF虽然不具有对RA诊断特异性，但其效价在判断预后上有重要作用。本研究表明，虽然RA患者血清中可出现上述三种自身抗体，但AKA与RF，AKA与抗CCP的出现无明显相关性，而抗CCP与RF之间的出现有相关性。在研究中我们还发现，在一个患者中可检测出一种、二种抗体，甚至可同时出现上述三种抗体，但也有一部分患者体内检测不出上述任何抗体，这一部分患者预后有待进一步的追踪研究。
参考文献：
[1] Youg B J J，M alya RK，leslie RDG，et al.Antrkeratin antibodies inrheum atoid arth ritis.BM J，1979，2：97-99.
[2] 范列英.类风湿性关节炎血清早期诊断指标的研究进展.中华医学检验杂志，2003，26（10）632-634.
[3] Vincent C et al. Ann Rheum Dis， 1989，48：712-722.
[4] Paimela L et al.Ann Rheum Dis，1992，51：743-746.
[5] 胡学芳，魏华，朱爱萍，等.抗环瓜氨酸肽抗体检测在类风湿关节炎诊断中的临床意义.中华检验医学杂志，2003，26（8）：489-487.
[6] Bas S， perneger TY.Diagnostic tests forrherum a to idarthritis：comparison of antibodies and IgM rheum a to id factorsRheum a to logy，2002，41（7）：809.