265500山东烟台市福山区人民医院
　　 药剂科
　　doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2011.06.013
　　异位康合剂是由莪术、水蛭、桃仁、川芎、蒲黄、黄芪等九味中药煎煮而成，为棕黄至棕褐色液体，气微香，味微苦。具有活血化瘀，止痛的作用。适用于子宫内膜异位症，中医辨证属寒凝、气滞血瘀症者。黄芪为其主要成分之一。
　　黄芪甲苷（Ⅳ）是黄芪的主要指标成分及活性成分之一，目前黄芪药材及复方中药制剂大多以黄芪甲苷为质量评价标准。黄芪甲苷由41个碳原子组成，属于三萜环阿屯烷型，其苷元为环黄芪醇，与二糖链相连形成三萜皂苷。黄芪甲苷能抗炎降压、镇痛镇静和促进再生肝DNA水平。
　　药理实验表明，黄芪甲苷具有改善白细胞变形能力，对抗体形成细胞数具有双向调节作用，可以调节机体状态，加强其适应能力，可以改善心肌收缩及舒张功能、促进胰岛素分泌，还能抑制自由基的产生和清除体内过剩的自由基，保护细胞免受自由基产生的过度氧化作用的影响，进而延长细胞寿命。
　　近年来，对黄芪甲苷的提取及含量测定方法的研究很多。提取方法除醇提法与水提法外，超声提取法、回流法、索氏提取法、高速离心法、超滤法、水提醇沉法等也有应用，既提高了收率，又降低了成本；其测定方法主要有高效液相色谱法、薄层扫描法、比色法等。2000年《中国药典》及《中国兽药典》采用薄层扫描法进行含量测定【sup】［1，2］【/sup】。该方法存在许多不足，像前处理步骤较多、排除干扰较困难、数据准确度较差等。本实验不予采用。而高效液相色谱法对样品的分离不受挥发度、热稳定性及分子量的影响，分离效能高，速度快，方法简单，数据的获得较容易。笔者参照《中国药典》2005年版高效液相色谱法及其他相关文献特探讨用高效液相色谱（HPLC）法对该制剂中黄芪甲苷的含量进行测定。目的是建立一种对异位康合剂进行质控的准确度高，灵敏度好的方法。
　　资料与方法
　　仪器：Waters高效液相色谱仪，510型泵，490E型紫外检测器，745型数据处理仪。对照品：黄芪甲苷购自中国药品生物制品检定所。样品：异位康合剂。试剂：乙腈为色谱纯，甲醇、正丁醇、乙醚均为分析纯，水为超纯水。
　　色谱条件：十八烷基键合硅胶柱（3.9mm×250mm），流动相乙腈-水（1:2.3），流速1.0ml/分，检测波长203nm，柱温为室温，灵敏度0.08AUFS。理论板数＞4000。
　　对照品溶液的制备：取黄芪甲苷标准品4.60mg（精密称取），加甲醇定溶于10ml的容量瓶中，超声震荡使充分溶解，作为对照品溶液。
　　标准曲线的绘制：精密吸取黄芪甲苷标准液200μl，分别以2.5，5，15，20，40μ进样l，按上述色谱条件测定，记录色谱峰。以峰面积为纵坐标，样品含量为横坐标，绘制工作曲线，得回归方程为Y208856X-33764，r0.9998；线性范围为1.15～18.4μg。
　　结 果
　　系统适用性实验：提取溶剂的预试取同批试样，精密量取20ml，分别置3支索氏提取器中，分别加甲醇、无水乙醇、95%乙醇60ml，加热回流提取至提取液无色，提取液浓缩至干，残渣加水20ml，微热使其溶解，先用乙醚振摇提取2次，再用水饱和的正丁醇振摇提取4次，合并正丁醇提取液后，用氨试液提取2次，20ml/次，弃去氨试液，正丁醇液蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液【sup】［4］【/sup】。取供试品溶液10μl进样，测定峰面积，计算黄芪甲苷的含量。结果表明，以甲醇为溶剂，含量测定结果最高。见表1。
　　提取方法试验：取同批试样，精密量取3份，每份20ml，样1置于索氏提取器中，加甲醇60ml，加热回流提取2小时；样2加甲醇60ml，超声处理2小时；样3加甲醇60ml，于80℃温浸提取2小时。其余按提取溶剂预试方法制备。分别取3种供试品溶液10μl进样，测定峰面积，计算黄芪甲苷的含量，结果表明，用索氏提取器回流提取测得的黄芪甲苷含量最高。见表2。
　　提取时间的试验：取同批试样，分别精密量取6份，每份20ml，置索氏提取器中，分别加甲醇60ml，分别加热回流提取1小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时其余按提取溶剂方法制备。6种供试品溶液，分别取10μl进样，测定峰面积，计算黄芪甲苷的含量，结果表明，加热回流提取3小时测定的黄芪甲苷含量最高。
　　供试品溶液的制备：精密量取20ml供试品溶液，超声震荡14分钟，置索氏提取器中，加甲醇60ml，加热回流提取3小时，提取液浓缩至干后，残渣加水20ml，微热使其溶解，先用乙醚振摇提取2次，再用水饱和的正丁醇振摇提取4次，20ml/次，合并正丁醇提取液后，再用氨试液提取2次，20ml/次，将氨试液弃去，将正丁醇液蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为待测供试品溶液。
　　阴性对照液的制备：将去掉黄芪的另8味药按照供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液，分别取待测供试品溶液、阴性对照溶液和黄芪甲苷标准溶液20μl进样，依法测定，结果阴性对照液在黄芪甲苷色谱峰位置无相应峰，表明阴性无干扰。
　　精密度实验：精密量取黄芪甲苷对照品溶液（0.46μg/μl）15μl进样，连续6次，测定峰面积，其RSD为0.64%。
　　重复性试验：精密量取同一批号的供试品6份各20ml，按照供试品溶液制备方法制备成2ml待测溶液，精密吸取15μl进样，记录色谱图，测定峰面积积分值，结果RSD为0.81%，表明测定方法重现性较好。
　　回收率实验：精密量取已测黄芪甲苷含量的供试品样品6份，各10μl，分别准确加入黄苷对照品溶液（0.46mg/ml）2，2.5，3，3.5，4，4.5μl，进样，回收率平均值97.05%，RSD为0.89%。
　　稳定性实验：样品溶液（生品）在室温下放置，每隔3小时测定1次，12小时内共测定5次，含量（mg/g）分别是0.884，0.883，0.888，0.887，0.884，RSD为2.45%。证明样品液中黄芪甲苷含量至少在12小时内稳定。
　　定量测定：精密吸取上述待测样品20μl进样，分别测定3次，得峰面积分别675820、673349、681273取平均值676814Mv*秒。将该峰面积代入标准曲线方程得20μl样品中含黄芪甲苷3.40224μg，即异位康合剂中黄芪甲苷的含量为0.0425mg/ml。
　　讨 论
　　很多因素均可以影响黄芪中黄芪甲苷的含量，其含量可以从0.05%升高到0.23%。如产地不同，含量差别很大【sup】［5］【/sup】，《中国药典》规定两个正品蒙古黄芪和膜荚黄芪的含量较高，平均含量分别为0.108%和0.109%。加工炮制亦有影响，黄芪饮片浸泡时间过长，则检不出黄芪甲苷；蜜制亦导致含量下降。异位康合剂含量测定时，因前处理步骤较多，尤其是以碱水及水萃取洗涤，体积不宜过大，因黄芪甲苷分子量虽较大，但毕竟具苷类性质，必须注意减少损失。
　　黄芪甲苷含量测定的预处理中，许多相关文献在报道中都进行了碱性试剂预洗，目的是除去中药中的酸性成分。黄芪甲苷在酸性条件下水解得苷元黄芪甲醇，后者结构中的环丙烷环极易在酸水解时开裂，影响黄芪甲苷的含量测定。因此前处理过程中一定要有碱液的预洗。有的文献采用氨试液【sup】［9，15］【/sup】，也有的采用一定浓度的NaOH溶液【sup】【/sup】［7，8，10，11］，本实验经过比较表明，不用氨试液处理的样品，测定所得黄芪甲苷含量远低于用氨试液处理的样品，所以认为采用氨试液处理较好。
　　黄芪甲苷在紫外区仅在200nm左右有末端吸收，因此在200～210nm范围内选择测定波长。实验表明，波长越长，噪音越小，但灵敏度也降低。综合考察这两个因素，本实验选择203nm【sup】［16］【/sup】为测定波长。
　　本文考察了乙腈-水（1:2.0，1:2.2，1:2.3，1:4）等不同流动相，依实验结果选择乙腈-水（1:2.3）为最佳流动相根据文献报道，一般认为检测药物含量的方法以HPLC-UV法【sup】【/sup】［2，11，17，18］和HPLC-ELSD法【sup】［15］【/sup】较好，由于实验条件限制（无蒸发光散射检测器），所以本文采用的是HPLC-UV法。该法对于检测制剂中黄芪甲苷的含量具有重现性好、专属性强、灵敏度及准确度高的特点，可用于异位康合剂的质量控制。鉴于HPLC-ELSD法及较之更精确的检测方法，在以后的学习过程中将进一步分析、比较和探讨。
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　　 表1 提取溶剂的预实验结果
　　表2 提取方法试验结果