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目的建立液相色谱串联质谱法（liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS）同时测定血清24,25双羟基维生素D2[24,25-dihydroxyvitamin D2,24,25（OH）2D2]和24,25双羟维生素D3[24,25-dihydroxyvitamin D3,24,25（OH）2D3]的方法。方法首先采用乙腈和硫酸锌溶液沉淀血清蛋白,之后加入正己烷/乙酸乙酯震荡提取24,25（OH）2D、离心后吸取上清液、氮气挥干,再用流动相重组。以稳定同位素标记的24,25（OH）2D3-d6作内标。质谱采用正离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式,24,25（OH）2D2和24,25（OH）2D3定量离子通道选择质荷比分别为429. 3→271. 3和417. 3→381. 3;内标24,25（OH）2D3-d6离子通道m/z为423. 3→387. 3。以标准品峰面积与同位素内标峰面积比制作标准曲线,建立LC-MS/MS快速测定24,25（OH）2D2和24,25（OH）2D3的方法。根据EP15-A2文件评价方法的精密度,并初步测定40例北京协和医院表观健康体检者[年龄（35±5）岁,男性18例,女性22例]血清24,25（OH）3D的含量及其与25OHD的比值。结果本实验条件下可同时快速检测血清24,25（OH）2D2和24,25（OH）2D3,分析时间仅为7. 5 min,特异性高,不受3-epi 24,25（OH）2D3以及1,25（OH）2D的干扰。24,25（OH）2D2和24,25（OH）2D3与内标峰面积比与对应的浓度线性相关系数均>0. 999,24,25（OH）2D3重复性和实验室内不精密度分别为2. 46%～4. 81%和4. 33%～7. 21%,24,25（OH）2D2重复性和实验室内不精密度分别为4. 90%～6. 87%和5. 82%～9. 90%。24,25（OH）2D3和24,25（OH）2D2的加样回收率分别为91. 20%～96. 60%和92. 8%～105. 00%。24,25（OH）2D3和24,25（OH）2D2的定量限分别为0. 25和0. 5μg/L,检测限分别为0. 125和0. 25μg/L。初步分析北京协和医院40例体检人群血清,24,25（OH）2D的平均值为（0. 81±0. 43）μg/L,25OHD/24,25（OH）2D比值范围为8. 7～37. 2,平均值为18. 9±6. 7,性别间差异无统计学意义（P>0. 05）。结论本研究成功建立了LC-MS/MS快捷、准确测定血清24,25（OH）2D的方法。