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（1.湖南师范大学体育学院，湖南 长沙 410012；2. 湘南学院公共课部，湖南 郴州 423000；
3.宜春学院体育学院，江西 宜春 336000；4.湖南体育职业学院，湖南 长沙 410008）
摘 要：为观察虎纹捕鸟蜘蛛毒素-I(HWTX-I)对全脑缺血再灌注大鼠海马组织凋亡相关因子Caspase-3、Caspase-8mRNA及蛋白表达的影响。将SD大鼠随机分为假手术组、生理盐水组及用药组；采用改良的Pulsinelli“四血管阻断”法制备全脑缺血损伤模型并结合蛛网膜下腔置管术；免疫组织化学法检测Caspase-3、Caspase-8蛋白水平的表达；RT-PCR法检测凋亡相关因子Caspase-3、Caspase-8mRNA 表达变化。免疫组织化学法检测结果显示，HWTX-I能显著降低全脑缺血再灌注大鼠海马组织CA1区Caspase-3、Caspase-8蛋白水平的表达( P <0.05)；RT-PCR结果显示, HWTX-I能显著降低全脑缺血及再灌注大鼠海马组织Caspase-3、Caspase-8核酸水平的表达( P <0.05)。提示：HWTX-I蛛网膜下腔用药对全脑缺血再灌注SD大鼠海马组织的保护作用可能通过抑制凋亡相关因子Caspase-3、Caspase-8mRNA和蛋白表达，从而发挥其抗脑缺血再灌注损伤的保护作用。
关键词：虎纹蜘蛛毒素-I；脑缺血再灌注；海马；半胱天冬酶-3；半胱天冬酶-8
中图分类号：G804.7文献标识码：A文章编号：1007-3612(2008)10-1368-04
The Expression of Caspase-3,8 in the Hippocampus of Rat in Global Cerebral Ischemia and
Reperfusion and the Mechanism of Neural Protection with HWTX-I
LIU Ren-yi1,2, CHEN Jia-qin1, MAO Hai-feng3, WANG Yi-rong4,1
(1. College of Physical Education, Hunan Normal University, Changsha 410081, Hunan China; 2. Department of Common Curricula,
Xiangnan College, Chenzhou 423000, unan China; 3.Yichun College, Yichun 336000 Jiangxi China;
4.Hunan Physical Education Academy, Changsha 410008, Hunan China)
Abstract:To investigate the effects of Huwentoxin-I (HWTX-I) on expression of mRNA and protein of apoptotic correlation factors, such as Caspase-3, Caspase-8 in hippocampus tissue, after global cerebral ischimia and reperfusion in rats. 48 female SD rats randomly are divided into the sham-operation group, the physiological saline group and administration group, and each group consisted of 18 rats. the improved global cerebral ischemia damage models of Pulsinelli 4-blood vessal occlusion combined with the method of inserting anaesthesic tube into intrathecal space are adopted to detect the changes of the expression of Caspase-3 and Caspase-8, in protein by immunohistochemistry, and mRNA by RT-PCR. Immunohistochemical staining indicates that HWTX-I can lighten strong positive expression of Caspase-8 and Caspase-3 in hippocampal CA1 region, after global cerebral ischimia and reperfusion in rats ( P <0.05), and the expression of Caspase-8 and Caspase-3mRNA in the hippocampus tissue of administration group( P <0.05). It can be concluded that, injected into intrathecal space, HWTX-I tends to have anti-apoptotic role in the hippocampus tissues of rats subjected to transient ischemia,through inhibiting the expression of mRNA and protein of apoptotic correlation factors Caspase-3 and Caspase-8.
Key words: HWTX-I; cerebral ischemia and reperfusion; hippocampus; Caspase-3(p20); Caspase-8(p10)
虎纹毒素-I（HWTX-I）是从我国珍稀蜘蛛虎纹捕鸟蛛（Selenocosmia huwena）粗毒中分离纯化的一种天然多肽类神经毒素，能可逆地阻断小鼠膈神经－膈肌的神经传导，是一种作用于突触前膜的N型钙离子通道阻断剂[1]，探讨HWTX-I在运动医学中的应用，无疑具有重要的意义。目前本校已经完成HWTX-I作为国家I类镇痛新药开发的临床前实验，即将进入临床试验。HWTX-I分子结构、生物学作用和镇痛效应与美国Neurex公司开发的新型多肽镇痛药芋螺毒素(ω-conotoxin，MVIA)相似[2]，研究证实，芋螺毒素同时具有神经保护作用[3]。在我们前期的实验中发现，HWTX-I具有抗大鼠脑缺血损伤的神经细胞保护作用的迹象。大鼠海马CA1区是脑缺血损伤敏感区和易损区,我们通过观察HWTX-I对全脑缺血再灌注大鼠海马组织Caspase-3、Caspase-8凋亡相关因子mRNA及蛋白表达的影响，探测HWTX-I对脑缺血损伤海马组织保护作用的有效性和可能分子机制，为开发一种新型的神经保护作用药物提供理论和实验依据。
虎纹镇痛肽（HWTX-I）白色冻干粉针0.4 mg/西林瓶，由湖南师范大学蛋白质化学研究室分离纯化，深圳科兴生物制品公司制药厂加工成冻干粉针，批号:000418，通过质谱和高效液相以及小鼠膈神经阻断实验鉴定，纯度≥96％，应用剂量1.0 μg/kg。5～6周龄健康雄性SD大鼠48只，体重180～250 g，由湖南省卫生防疫站实验动物中心提供。免疫组化A、B、C试剂、DAB显色剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。Caspase-3一抗购自武汉博士德生物工程有限公司，Caspase-8一抗购自CellSience。上海生物工程技术服务有限公司合成Caspase-3、Caspase-8及GAPDH引物。此外包括PCR试剂、抽提总RNA试剂、反转录试剂等。主要仪器：PCR仪（eppendorf,德国），旋转切片机（HM3401型,德国MICROM），凝胶成象分析系统（GIS-1000型,Tanon）,专业图像分析系统（SimplePCI,美国）。
1 研究方法
1.1 实验动物分组 48只大鼠随机分为3组：假手术组、生理盐水组、用药组，每组16只，其中每组有8只进行Caspase-3、Caspase-8免疫组化检测，另8只用于做RT-PCR检测。
1.2 实验动物模型构建 具体过程如下：根据Pulsinelli[4]“四血管闭塞”全脑缺血再灌注损伤模型结合Yaksh TL等[5]蛛网膜下腔置管术，经适当改进建立该实验动物模型。具体操作过程如下：
10％水合氯醛腹腔注射麻醉SD大鼠（0.4 mL/100 g体重），于枕骨下沿背正中线切开约1.5 cm长口子，暴露第一颈椎，找到后弓上的翼突孔，用灼热的电烙铁尖头将孔内的椎动脉烧断。随即进行蛛网膜下腔置管：暴露寰枕后膜，在蛛网膜上小心地勾破出一小孔，插入PE10管（聚乙烯管，外径0.61 mm，内径0.28 mm，美国进口）至蛛网膜下腔，插入深度为2 cm，外端约留5 cm长到达脊髓腰膨大水平处，在管开口端预先用封口膜缠一小结球以确定插入深度，缝合小球固定在颈背肌上。热封闭暴露在外的PE-10管口以防感染，埋管，缝合切口。上述手术24 h后，进行颈总动脉夹闭：10％水合氯醛腹腔注射麻醉（0.3 mL/100 g鼠体重），大鼠仰卧于手术板上，剪去颈前部鼠毛，络合碘消毒，在两前肢直线上方沿腹正中线切开2 cm长皮肤口子，分离皮下脂肪、筋膜、肌肉直至大鼠气管，注意勿伤及气管，否则易引起喉部及气管水肿，导致大鼠迅速窒息，用玻璃分针于气管两侧下方分离颈总动脉，微型无创动脉夹夹闭两侧颈总动脉，10 min后松开动脉夹，缝合伤口，手术区域涂络合碘消毒，术后肌肉注射20万单位青霉素钠消炎。
1.3 给药方法 假手术组仅切开组织和皮肤，但不夹闭不给药。HWTX-I组于夹闭后立即给药，分别按1.0 μg/kg剂量给药，给药时用微量注射器将药物直接注入大鼠蛛网膜下腔内，随后再注入10 μL生理盐水冲洗封闭PE10管。生理盐水组于夹闭后注入等量生理盐水。HWTX-I组与生理盐水组大鼠缺血再灌注3 d，每日注射1次，至第4日处死取材。
1.4 取材和切片 大鼠再灌注72 h后,经腹腔注射10％水合氯醛（0.3 mL/100 g体重）麻醉后，仰卧位固定于手术台上，剪开腹壁，暴露隔肌，小心剪开隔肌，暴露心脏。用灌流穿刺针经心尖部刺入左心室沿心脏纵轴方向至主动脉根部，止血钳固定灌流穿刺针。之后在右心耳处剪一小口将血液放出。用约100 mL 0.9%生理盐水灌流，待右心耳流出液变清亮时，再用4％多聚甲醛磷酸缓冲液（0.1M，pH＝7.4）200～250 mL灌流，一般灌流时间不少于20 min。灌流结束后取出脑组织标本，固定于4％多聚甲醛磷酸缓冲液（0.1M，pH＝7.4）中12 h以上，然后石蜡包埋，进行组织切片，组织切片厚为5 μm，每一载玻片约3～4张切片。
1.5 免疫组织化学检测
1.5.1 免疫组化实验步骤 石蜡切片,常规脱蜡复水后于3 %H2O2去离子水孵育8 min,以消除内源性过氧化物酶的活性；蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min；加热进行抗原修复10 min；正常羊血清室温下孵育12 min,倾去，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗（溶剂为PBS，两者的比例为1：100），4℃ 过夜；PBS冲洗，5 min×3次；滴加试剂B，37℃下孵育15 min ；PBS冲洗，5 min×3次；滴加试剂C，37℃下孵育15 min；PBS冲洗，5 min×3次； DAB 显色剂显色，终止反应后, 苏木素复染、脱水、透明、封片，并且在光学显微镜下观察、拍照。
1.5.2 免疫组织化学染色图像的处理与分析 用SimplePCI图像分析系统对免疫组化测试区的平均灰度级、阳性产物的平均灰度与面积、背景面积进行测量，并且计算阳性单位PU，计算公式为PU=100×|Gα-GA|／［(1-n／m+n)×Gmax］[6]，其中GA为测试区A的平均灰度级；Gα为阳性反应产物α相的平均灰度级；n为阳性反应产物的面积；m为背景面积；Gmax为测试仪器的最大灰度分级。
1.6 总RNA抽提与RT-PCR检测
1.6.1 总RNA的抽提 断颈处死大鼠，在无菌操作条件下取出右半球海马，放入已消毒处理过的EP管内，手动匀浆，加1 mL Trizol 于匀浆器中，用移液枪反复抽吸捣碎组织，振荡混匀；加200 μL氯仿，振荡混匀；4℃，12 000 rpm离心10 min，取上清液，后加500 μL异丙醇，-20℃保存1 h以上；4℃，12 000 rpm离心15 min，去上清，再用80%乙醇洗涤，静置片刻；4℃，12 000 rpm离心5 min，去上清，EP管口朝上干燥20 min以上便于乙醇挥发，再按沉淀的多少酌情加入DEPC水溶解，振荡混匀。
1.6.2 RT-PCR操作步骤
1.6.2.1 反转录 总反应体系为20 μL。取10 μL RNA于72℃变性2 min，后冰浴2 min，再在EP管内分别加入4 μL Mgcl2、2 μL 10×Buffer、2 μL dNTP、0.5 μL inhibitor、1 μL AMV反转录酶和1μl Oligo primer，此操作均在冰桶内进行。再将装有上述混合液的EP管放入恒温箱内，条件设定为：42℃，90 min；99℃，5 min 。然后-20℃保存，获得cDNA的第一链。
1.6.2.2 聚合酶链式反应 Caspase-3、Caspase-8引物合成序列分述如下：Caspase-3上下游引物分别为5′-caatggtaccgatgtcgatg -3和5′- gacccgtcccttgaatttct -3，产物大小为447 bp；Caspase-8上下游引物分别为5′-ggaaggatcgacgattacga -3′和5′- cccttgtccccatgtgatag -3′,产物大小为452 bp；内参照GAPDH上下游引物分别为 5′-tcaccatcttccaggagcgag-3′和5′-tgtcgctgttgaagtcagag-3′，产物大小为697 bp。
总反应体系为20 μL。往20 μL EP管加80 μL无菌水，稀释至100 μL，作为cDNA模板；取1 μL cDNA模板，分别加入5×Buffer 4 μL，2.5 mM dNTP 0.25 μL，GAPDH3' 0.5 μL，GAPDH5' 0.5 μL，Caspase-3（或Caspase-8）上下游引物分别为1 μL，Taq酶0.125 μL，无菌水11.5 μL。此操作均在冰桶内进行。PCR反应条件的设计：94℃，5 min；94℃，45 s；60℃，45 s；72℃，1 min；30个循环；72℃延伸10 min。
1.6.2.3 琼脂糖凝胶电泳 8 μL PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察并拍照。
1.6.3 图像处理与分析 用SimplePCI图像分析软件对看家基因GAPDH和目的基因表达电泳条带的灰度值和面积进行测量，计算比值R，R为同一组内目的基因表达电泳条带的灰度值g与面积值a的乘积比上看家基因表达的条带灰度值G与面积A乘积的值，即R=g×a/(G×A)，其中g、a、G、A为同一组别的测量值，R值的大小反映目的基因表达的强弱。
2.7 统计学方法 假手术组、生理盐水组和用药组分别以平均数±标准差（ X±S ）表示各定量指标平均值和离散程度，采用SPSS11.5统计软件进行分析，样本均数的比较采用成组设计多个样本均数比较的单因素方差分析， P<0.05为差异具有显著统计学意义，P <0.01为差异具有非常显著统计学意义。
2 结 果
2.1 免疫组织化学检测
2.1.1 免疫组化定性实验 从图1-I、II中，我们可以观察到：假手术组海马CA1区几乎未见Caspase-3、Caspase-8表达（黄色为Caspase-3、 Caspase-8的阳性表达）；生理盐水组海马CA1区出现较强的Caspase-3、Caspase-8表达，阳性细胞数量多；用药组海马CA1区有次强的Caspase-3、 Caspase-8表达，阳性细胞分布明显较生理盐水组少而稀疏。
I Caspase-3蛋白表达 II Caspase-8蛋白表达
图1 大鼠海马CA1区凋亡蛋白表达的免疫组织化学定位A
（×16），B、C（×160）
注：图1-I、II中的A、B、C分别为假手术组、生理盐水组和用药组。2.1.2 免疫组化半定量实验 统计结果显示（表1）：Caspase-3、Caspase-8阳性单位值以生理盐水组为高，用药组和假术组与随之降低；假手术组Caspase-3、Caspase-8表达与生理盐水组比较，差异具有非常显著性意义（ P <0.01）；生理盐水组Caspase-3、Caspase-8表达与用药组比较，差异具有显著性意义（ P <0.05）；HWTX-I具有较明显降低缺血再灌注大鼠海马Caspase-3 、Caspase-8表达的作用。
2.2.1 琼脂糖凝胶电泳结果 在图2-I中每条泳道中，600 bp～700 bp之间可见GAPDH表达的条带G，产物大小为697 bp，在400 bp～500 bp之间分别可见假手术组、生理盐水组、用药组Caspase-3mRNA扩增出来的cDNA条带A、B、C，产物大小为447 bp；在图2-II中每条泳道中，600 bp～700 bp之间可见表达的GAPDH条带G，产物大小为697 bp，在400 bp～500 bp之间分别可见假手术组、生理盐水组、用药组Caspase8 mRNA扩增出来的cDNA条带A、B、C，产物大小为452 bp；假手术组也存在Caspase-3、Caspase-8mRNA表达。
2.2.2 数据统计分析结果 在大鼠海马CA1区通过SimplePCI图像分析与数据统计学处理，结果显示：假手术组Caspase-3表达量与生理盐水组比较，差异具有非常显著性意义( P <0.01)；用药组Caspase-3表达与生理盐水组比较，差异具有显著性意义( P <0.05)。假手术组Caspase-8表达量与生理盐水组比较，差异具有显著性意义( P <0.05)；用药组Caspase-8与生理盐水组表达比较差异具有显著性意义( P <0.05)。HWTX-I具有较明显降低缺血再灌注大鼠海马Caspase-3 、Caspase-8表达的作用(表2)。
3 分析与讨论
脑缺血时，胞内钙急剧增高可能来自两个方面:胞外钙内流和胞内钙释放，其中胞外Ca2+内流可能主要通过细胞膜上的两种通道完成的:一个是由能量衰竭造成的电压门控钙通道开放,另一个是由兴奋性氨基酸在细胞外堆积激活谷氨酸受体造成的受体门控钙通道开放。Werling[7]证实，脑缺血时，电压依赖性通道开放时间延长,Ca2+内流增加，然而也有学者[8]认为细胞膜钙通道对脑缺血胞内钙积聚不起主要作用。Ca2+超载及其所触发的一系列有害代谢是导致神经细胞死亡的“最后共同通路”[9]。 Greenberg[10]和Lysko[11]的实验证明缺血后脑组织钙离子的聚积与组织损害、脑水肿程度一致。
胞内钙超载将激活一些凋亡因子的表达。在实验性脑缺血的在体大量研究证实Caspase-3介导脑缺血凋亡的过程，脑缺血后不仅Caspase-3基因的转录增强,而且其蛋白酶活性也有所改变，短暂全脑缺血后海马区神经元凋亡数与Caspase-3活性呈显著正相关。Ni[12]等发现大鼠短暂性全脑缺血后,海马CA1区锥体神经元可见Caspase-3 mRNA表达上调, 在缺血24 h其上调最显著,这种高水平的表达,可持续72 h,而到缺血96 h后,则显著下降。Caspase-3的激活可以通过死亡受体介导的和细胞内线粒体介导的两条途径, 两条途径分别活化Caspase-8和Caspase-9，继而激活Caspase-3后引发Caspase蛋白水解级联的“瀑布效应”。活化的Caspase-3可通过水解特异性蛋白底物从多方面促进凋亡的发生，如对结构蛋白及看家蛋白的水解,促使细胞骨架结构破坏，而对DNA裂解酶的抑制蛋白的水解，使DNA裂解酶活化，直接导致细胞的凋亡；另一方面Caspase-3水解并灭活DNA修复酶阻止DNA修复。因此，Caspase-3作为细胞凋亡信号转导中的关键性效应酶参与脑缺血神经细胞的凋亡，而Caspase-8则是介导于死亡受体凋亡通路重要的蛋白酶。
在本实验中发现，假手术组大鼠海马组织Caspase-3、Caspase-8mRNA及蛋白有少量表达，说明在非应激状态下海马组织就有Caspase-3、Caspase-8基因的少量表达,这可能与保持神经系统稳定性，防止基因突变发生有关。用药组Caspase-3、Caspase-8mRNA及蛋白表达明显比生理盐水组低，因而HWTX-I具有较明显降低缺血再灌注大鼠海马组织凋亡相关因子Caspase-3、Caspase-8 mRNA及蛋白表达的作用，这提示HWTX-I具有抗脑缺血再灌注损伤的保护作用。细胞形态学改变是细胞凋亡的一个基本特征，结合我们的前期研究发现大鼠海马组织切片经过Nissl染色后在光镜下观察，生理盐水组和假手术组及用药组海马CA1区锥体神经元有着不同的形态学变化，其中假手术组可见数层锥体神经元，排列整齐紧密。用药组锥体神经元，排列较整齐，略为疏散分布，而生理盐水组锥体神经元排列散乱，层次不完整，稀疏分布；在超微结构方面也有着不同的变化，电镜观察结果显示生理盐水组线粒体嵴模糊不清，出现空泡化等破坏现象，假手术组及用药组大鼠海马细胞的线粒体嵴清晰可见。因此，从形态学上的观察结果来看，HWTX-I对脑缺血大鼠海马CA1区组织也具有神经保护作用。我们推测脑缺血后其神经保护的可能机制是通过HWTX-I作用于突触前膜的N型钙离子通道，在一定程度上有效阻碍胞外钙离子的内流，从而抑制了由于胞内钙离子聚集而激活Caspase-3、Caspase-8mRNA和蛋白表达，减轻了海马组织损伤的程度。本实验结果也提示突触前N型Ca2+通道的激活是脑缺血时钙离子内流的一个重要的原因，死亡受体凋亡通路可能在脑缺血损伤中被激动活,通过此类钙拮抗剂的应用能够达到很好的脑缺血损伤治疗作用。本实验显示随着HWTX-I神经保护作用机制的深入研究，HWTX-I可望成为临床治疗缺血性刺激引起颅脑损伤的有效药物,在运动医学领域有可能具有较好的应用前景。
4 结 论
HWTX-I蛛网膜下腔用药对全脑缺血及再灌注SD大鼠海马组织的保护作用可能通过抑制凋亡相关因子Caspase-3、Caspase-8 mRNA和蛋白表达，从而发挥其抗脑缺血再灌注损伤的保护作用。
参考文献：
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3.宜春学院体育学院，江西 宜春 336000；4.湖南体育职业学院，湖南 长沙 410008）
摘 要：为观察虎纹捕鸟蜘蛛毒素-I(HWTX-I)对全脑缺血再灌注大鼠海马组织凋亡相关因子Caspase-3、Caspase-8mRNA及蛋白表达的影响。将SD大鼠随机分为假手术组、生理盐水组及用药组；采用改良的Pulsinelli“四血管阻断”法制备全脑缺血损伤模型并结合蛛网膜下腔置管术；免疫组织化学法检测Caspase-3、Caspase-8蛋白水平的表达；RT-PCR法检测凋亡相关因子Caspase-3、Caspase-8mRNA 表达变化。免疫组织化学法检测结果显示，HWTX-I能显著降低全脑缺血再灌注大鼠海马组织CA1区Caspase-3、Caspase-8蛋白水平的表达( P <0.05)；RT-PCR结果显示, HWTX-I能显著降低全脑缺血及再灌注大鼠海马组织Caspase-3、Caspase-8核酸水平的表达( P <0.05)。提示：HWTX-I蛛网膜下腔用药对全脑缺血再灌注SD大鼠海马组织的保护作用可能通过抑制凋亡相关因子Caspase-3、Caspase-8mRNA和蛋白表达，从而发挥其抗脑缺血再灌注损伤的保护作用。
关键词：虎纹蜘蛛毒素-I；脑缺血再灌注；海马；半胱天冬酶-3；半胱天冬酶-8
中图分类号：G804.7文献标识码：A文章编号：1007-3612(2008)10-1368-04
The Expression of Caspase-3,8 in the Hippocampus of Rat in Global Cerebral Ischemia and
Reperfusion and the Mechanism of Neural Protection with HWTX-I
LIU Ren-yi1,2, CHEN Jia-qin1, MAO Hai-feng3, WANG Yi-rong4,1
(1. College of Physical Education, Hunan Normal University, Changsha 410081, Hunan China; 2. Department of Common Curricula,
Xiangnan College, Chenzhou 423000, unan China; 3.Yichun College, Yichun 336000 Jiangxi China;
4.Hunan Physical Education Academy, Changsha 410008, Hunan China)
Abstract:To investigate the effects of Huwentoxin-I (HWTX-I) on expression of mRNA and protein of apoptotic correlation factors, such as Caspase-3, Caspase-8 in hippocampus tissue, after global cerebral ischimia and reperfusion in rats. 48 female SD rats randomly are divided into the sham-operation group, the physiological saline group and administration group, and each group consisted of 18 rats. the improved global cerebral ischemia damage models of Pulsinelli 4-blood vessal occlusion combined with the method of inserting anaesthesic tube into intrathecal space are adopted to detect the changes of the expression of Caspase-3 and Caspase-8, in protein by immunohistochemistry, and mRNA by RT-PCR. Immunohistochemical staining indicates that HWTX-I can lighten strong positive expression of Caspase-8 and Caspase-3 in hippocampal CA1 region, after global cerebral ischimia and reperfusion in rats ( P <0.05), and the expression of Caspase-8 and Caspase-3mRNA in the hippocampus tissue of administration group( P <0.05). It can be concluded that, injected into intrathecal space, HWTX-I tends to have anti-apoptotic role in the hippocampus tissues of rats subjected to transient ischemia,through inhibiting the expression of mRNA and protein of apoptotic correlation factors Caspase-3 and Caspase-8.
Key words: HWTX-I; cerebral ischemia and reperfusion; hippocampus; Caspase-3(p20); Caspase-8(p10)
虎纹毒素-I（HWTX-I）是从我国珍稀蜘蛛虎纹捕鸟蛛（Selenocosmia huwena）粗毒中分离纯化的一种天然多肽类神经毒素，能可逆地阻断小鼠膈神经－膈肌的神经传导，是一种作用于突触前膜的N型钙离子通道阻断剂[1]，探讨HWTX-I在运动医学中的应用，无疑具有重要的意义。目前本校已经完成HWTX-I作为国家I类镇痛新药开发的临床前实验，即将进入临床试验。HWTX-I分子结构、生物学作用和镇痛效应与美国Neurex公司开发的新型多肽镇痛药芋螺毒素(ω-conotoxin，MVIA)相似[2]，研究证实，芋螺毒素同时具有神经保护作用[3]。在我们前期的实验中发现，HWTX-I具有抗大鼠脑缺血损伤的神经细胞保护作用的迹象。大鼠海马CA1区是脑缺血损伤敏感区和易损区,我们通过观察HWTX-I对全脑缺血再灌注大鼠海马组织Caspase-3、Caspase-8凋亡相关因子mRNA及蛋白表达的影响，探测HWTX-I对脑缺血损伤海马组织保护作用的有效性和可能分子机制，为开发一种新型的神经保护作用药物提供理论和实验依据。
虎纹镇痛肽（HWTX-I）白色冻干粉针0.4 mg/西林瓶，由湖南师范大学蛋白质化学研究室分离纯化，深圳科兴生物制品公司制药厂加工成冻干粉针，批号:000418，通过质谱和高效液相以及小鼠膈神经阻断实验鉴定，纯度≥96％，应用剂量1.0 μg/kg。5～6周龄健康雄性SD大鼠48只，体重180～250 g，由湖南省卫生防疫站实验动物中心提供。免疫组化A、B、C试剂、DAB显色剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。Caspase-3一抗购自武汉博士德生物工程有限公司，Caspase-8一抗购自CellSience。上海生物工程技术服务有限公司合成Caspase-3、Caspase-8及GAPDH引物。此外包括PCR试剂、抽提总RNA试剂、反转录试剂等。主要仪器：PCR仪（eppendorf,德国），旋转切片机（HM3401型,德国MICROM），凝胶成象分析系统（GIS-1000型,Tanon）,专业图像分析系统（SimplePCI,美国）。
1 研究方法
1.1 实验动物分组 48只大鼠随机分为3组：假手术组、生理盐水组、用药组，每组16只，其中每组有8只进行Caspase-3、Caspase-8免疫组化检测，另8只用于做RT-PCR检测。
1.2 实验动物模型构建 具体过程如下：根据Pulsinelli[4]“四血管闭塞”全脑缺血再灌注损伤模型结合Yaksh TL等[5]蛛网膜下腔置管术，经适当改进建立该实验动物模型。具体操作过程如下：
10％水合氯醛腹腔注射麻醉SD大鼠（0.4 mL/100 g体重），于枕骨下沿背正中线切开约1.5 cm长口子，暴露第一颈椎，找到后弓上的翼突孔，用灼热的电烙铁尖头将孔内的椎动脉烧断。随即进行蛛网膜下腔置管：暴露寰枕后膜，在蛛网膜上小心地勾破出一小孔，插入PE10管（聚乙烯管，外径0.61 mm，内径0.28 mm，美国进口）至蛛网膜下腔，插入深度为2 cm，外端约留5 cm长到达脊髓腰膨大水平处，在管开口端预先用封口膜缠一小结球以确定插入深度，缝合小球固定在颈背肌上。热封闭暴露在外的PE-10管口以防感染，埋管，缝合切口。上述手术24 h后，进行颈总动脉夹闭：10％水合氯醛腹腔注射麻醉（0.3 mL/100 g鼠体重），大鼠仰卧于手术板上，剪去颈前部鼠毛，络合碘消毒，在两前肢直线上方沿腹正中线切开2 cm长皮肤口子，分离皮下脂肪、筋膜、肌肉直至大鼠气管，注意勿伤及气管，否则易引起喉部及气管水肿，导致大鼠迅速窒息，用玻璃分针于气管两侧下方分离颈总动脉，微型无创动脉夹夹闭两侧颈总动脉，10 min后松开动脉夹，缝合伤口，手术区域涂络合碘消毒，术后肌肉注射20万单位青霉素钠消炎。
1.3 给药方法 假手术组仅切开组织和皮肤，但不夹闭不给药。HWTX-I组于夹闭后立即给药，分别按1.0 μg/kg剂量给药，给药时用微量注射器将药物直接注入大鼠蛛网膜下腔内，随后再注入10 μL生理盐水冲洗封闭PE10管。生理盐水组于夹闭后注入等量生理盐水。HWTX-I组与生理盐水组大鼠缺血再灌注3 d，每日注射1次，至第4日处死取材。
1.4 取材和切片 大鼠再灌注72 h后,经腹腔注射10％水合氯醛（0.3 mL/100 g体重）麻醉后，仰卧位固定于手术台上，剪开腹壁，暴露隔肌，小心剪开隔肌，暴露心脏。用灌流穿刺针经心尖部刺入左心室沿心脏纵轴方向至主动脉根部，止血钳固定灌流穿刺针。之后在右心耳处剪一小口将血液放出。用约100 mL 0.9%生理盐水灌流，待右心耳流出液变清亮时，再用4％多聚甲醛磷酸缓冲液（0.1M，pH＝7.4）200～250 mL灌流，一般灌流时间不少于20 min。灌流结束后取出脑组织标本，固定于4％多聚甲醛磷酸缓冲液（0.1M，pH＝7.4）中12 h以上，然后石蜡包埋，进行组织切片，组织切片厚为5 μm，每一载玻片约3～4张切片。
1.5 免疫组织化学检测
1.5.1 免疫组化实验步骤 石蜡切片,常规脱蜡复水后于3 %H2O2去离子水孵育8 min,以消除内源性过氧化物酶的活性；蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min；加热进行抗原修复10 min；正常羊血清室温下孵育12 min,倾去，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗（溶剂为PBS，两者的比例为1：100），4℃ 过夜；PBS冲洗，5 min×3次；滴加试剂B，37℃下孵育15 min ；PBS冲洗，5 min×3次；滴加试剂C，37℃下孵育15 min；PBS冲洗，5 min×3次； DAB 显色剂显色，终止反应后, 苏木素复染、脱水、透明、封片，并且在光学显微镜下观察、拍照。
1.5.2 免疫组织化学染色图像的处理与分析 用SimplePCI图像分析系统对免疫组化测试区的平均灰度级、阳性产物的平均灰度与面积、背景面积进行测量，并且计算阳性单位PU，计算公式为PU=100×|Gα-GA|／［(1-n／m+n)×Gmax］[6]，其中GA为测试区A的平均灰度级；Gα为阳性反应产物α相的平均灰度级；n为阳性反应产物的面积；m为背景面积；Gmax为测试仪器的最大灰度分级。
1.6 总RNA抽提与RT-PCR检测
1.6.1 总RNA的抽提 断颈处死大鼠，在无菌操作条件下取出右半球海马，放入已消毒处理过的EP管内，手动匀浆，加1 mL Trizol 于匀浆器中，用移液枪反复抽吸捣碎组织，振荡混匀；加200 μL氯仿，振荡混匀；4℃，12 000 rpm离心10 min，取上清液，后加500 μL异丙醇，-20℃保存1 h以上；4℃，12 000 rpm离心15 min，去上清，再用80%乙醇洗涤，静置片刻；4℃，12 000 rpm离心5 min，去上清，EP管口朝上干燥20 min以上便于乙醇挥发，再按沉淀的多少酌情加入DEPC水溶解，振荡混匀。
1.6.2 RT-PCR操作步骤
1.6.2.1 反转录 总反应体系为20 μL。取10 μL RNA于72℃变性2 min，后冰浴2 min，再在EP管内分别加入4 μL Mgcl2、2 μL 10×Buffer、2 μL dNTP、0.5 μL inhibitor、1 μL AMV反转录酶和1μl Oligo primer，此操作均在冰桶内进行。再将装有上述混合液的EP管放入恒温箱内，条件设定为：42℃，90 min；99℃，5 min 。然后-20℃保存，获得cDNA的第一链。
1.6.2.2 聚合酶链式反应 Caspase-3、Caspase-8引物合成序列分述如下：Caspase-3上下游引物分别为5′-caatggtaccgatgtcgatg -3和5′- gacccgtcccttgaatttct -3，产物大小为447 bp；Caspase-8上下游引物分别为5′-ggaaggatcgacgattacga -3′和5′- cccttgtccccatgtgatag -3′,产物大小为452 bp；内参照GAPDH上下游引物分别为 5′-tcaccatcttccaggagcgag-3′和5′-tgtcgctgttgaagtcagag-3′，产物大小为697 bp。
总反应体系为20 μL。往20 μL EP管加80 μL无菌水，稀释至100 μL，作为cDNA模板；取1 μL cDNA模板，分别加入5×Buffer 4 μL，2.5 mM dNTP 0.25 μL，GAPDH3' 0.5 μL，GAPDH5' 0.5 μL，Caspase-3（或Caspase-8）上下游引物分别为1 μL，Taq酶0.125 μL，无菌水11.5 μL。此操作均在冰桶内进行。PCR反应条件的设计：94℃，5 min；94℃，45 s；60℃，45 s；72℃，1 min；30个循环；72℃延伸10 min。
1.6.2.3 琼脂糖凝胶电泳 8 μL PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察并拍照。
1.6.3 图像处理与分析 用SimplePCI图像分析软件对看家基因GAPDH和目的基因表达电泳条带的灰度值和面积进行测量，计算比值R，R为同一组内目的基因表达电泳条带的灰度值g与面积值a的乘积比上看家基因表达的条带灰度值G与面积A乘积的值，即R=g×a/(G×A)，其中g、a、G、A为同一组别的测量值，R值的大小反映目的基因表达的强弱。
2.7 统计学方法 假手术组、生理盐水组和用药组分别以平均数±标准差（ X±S ）表示各定量指标平均值和离散程度，采用SPSS11.5统计软件进行分析，样本均数的比较采用成组设计多个样本均数比较的单因素方差分析， P<0.05为差异具有显著统计学意义，P <0.01为差异具有非常显著统计学意义。
2 结 果
2.1 免疫组织化学检测
2.1.1 免疫组化定性实验 从图1-I、II中，我们可以观察到：假手术组海马CA1区几乎未见Caspase-3、Caspase-8表达（黄色为Caspase-3、 Caspase-8的阳性表达）；生理盐水组海马CA1区出现较强的Caspase-3、Caspase-8表达，阳性细胞数量多；用药组海马CA1区有次强的Caspase-3、 Caspase-8表达，阳性细胞分布明显较生理盐水组少而稀疏。
I Caspase-3蛋白表达 II Caspase-8蛋白表达
图1 大鼠海马CA1区凋亡蛋白表达的免疫组织化学定位A
（×16），B、C（×160）
注：图1-I、II中的A、B、C分别为假手术组、生理盐水组和用药组。2.1.2 免疫组化半定量实验 统计结果显示（表1）：Caspase-3、Caspase-8阳性单位值以生理盐水组为高，用药组和假术组与随之降低；假手术组Caspase-3、Caspase-8表达与生理盐水组比较，差异具有非常显著性意义（ P <0.01）；生理盐水组Caspase-3、Caspase-8表达与用药组比较，差异具有显著性意义（ P <0.05）；HWTX-I具有较明显降低缺血再灌注大鼠海马Caspase-3 、Caspase-8表达的作用。
2.2.1 琼脂糖凝胶电泳结果 在图2-I中每条泳道中，600 bp～700 bp之间可见GAPDH表达的条带G，产物大小为697 bp，在400 bp～500 bp之间分别可见假手术组、生理盐水组、用药组Caspase-3mRNA扩增出来的cDNA条带A、B、C，产物大小为447 bp；在图2-II中每条泳道中，600 bp～700 bp之间可见表达的GAPDH条带G，产物大小为697 bp，在400 bp～500 bp之间分别可见假手术组、生理盐水组、用药组Caspase8 mRNA扩增出来的cDNA条带A、B、C，产物大小为452 bp；假手术组也存在Caspase-3、Caspase-8mRNA表达。
2.2.2 数据统计分析结果 在大鼠海马CA1区通过SimplePCI图像分析与数据统计学处理，结果显示：假手术组Caspase-3表达量与生理盐水组比较，差异具有非常显著性意义( P <0.01)；用药组Caspase-3表达与生理盐水组比较，差异具有显著性意义( P <0.05)。假手术组Caspase-8表达量与生理盐水组比较，差异具有显著性意义( P <0.05)；用药组Caspase-8与生理盐水组表达比较差异具有显著性意义( P <0.05)。HWTX-I具有较明显降低缺血再灌注大鼠海马Caspase-3 、Caspase-8表达的作用(表2)。
3 分析与讨论
脑缺血时，胞内钙急剧增高可能来自两个方面:胞外钙内流和胞内钙释放，其中胞外Ca2+内流可能主要通过细胞膜上的两种通道完成的:一个是由能量衰竭造成的电压门控钙通道开放,另一个是由兴奋性氨基酸在细胞外堆积激活谷氨酸受体造成的受体门控钙通道开放。Werling[7]证实，脑缺血时，电压依赖性通道开放时间延长,Ca2+内流增加，然而也有学者[8]认为细胞膜钙通道对脑缺血胞内钙积聚不起主要作用。Ca2+超载及其所触发的一系列有害代谢是导致神经细胞死亡的“最后共同通路”[9]。 Greenberg[10]和Lysko[11]的实验证明缺血后脑组织钙离子的聚积与组织损害、脑水肿程度一致。
胞内钙超载将激活一些凋亡因子的表达。在实验性脑缺血的在体大量研究证实Caspase-3介导脑缺血凋亡的过程，脑缺血后不仅Caspase-3基因的转录增强,而且其蛋白酶活性也有所改变，短暂全脑缺血后海马区神经元凋亡数与Caspase-3活性呈显著正相关。Ni[12]等发现大鼠短暂性全脑缺血后,海马CA1区锥体神经元可见Caspase-3 mRNA表达上调, 在缺血24 h其上调最显著,这种高水平的表达,可持续72 h,而到缺血96 h后,则显著下降。Caspase-3的激活可以通过死亡受体介导的和细胞内线粒体介导的两条途径, 两条途径分别活化Caspase-8和Caspase-9，继而激活Caspase-3后引发Caspase蛋白水解级联的“瀑布效应”。活化的Caspase-3可通过水解特异性蛋白底物从多方面促进凋亡的发生，如对结构蛋白及看家蛋白的水解,促使细胞骨架结构破坏，而对DNA裂解酶的抑制蛋白的水解，使DNA裂解酶活化，直接导致细胞的凋亡；另一方面Caspase-3水解并灭活DNA修复酶阻止DNA修复。因此，Caspase-3作为细胞凋亡信号转导中的关键性效应酶参与脑缺血神经细胞的凋亡，而Caspase-8则是介导于死亡受体凋亡通路重要的蛋白酶。
在本实验中发现，假手术组大鼠海马组织Caspase-3、Caspase-8mRNA及蛋白有少量表达，说明在非应激状态下海马组织就有Caspase-3、Caspase-8基因的少量表达,这可能与保持神经系统稳定性，防止基因突变发生有关。用药组Caspase-3、Caspase-8mRNA及蛋白表达明显比生理盐水组低，因而HWTX-I具有较明显降低缺血再灌注大鼠海马组织凋亡相关因子Caspase-3、Caspase-8 mRNA及蛋白表达的作用，这提示HWTX-I具有抗脑缺血再灌注损伤的保护作用。细胞形态学改变是细胞凋亡的一个基本特征，结合我们的前期研究发现大鼠海马组织切片经过Nissl染色后在光镜下观察，生理盐水组和假手术组及用药组海马CA1区锥体神经元有着不同的形态学变化，其中假手术组可见数层锥体神经元，排列整齐紧密。用药组锥体神经元，排列较整齐，略为疏散分布，而生理盐水组锥体神经元排列散乱，层次不完整，稀疏分布；在超微结构方面也有着不同的变化，电镜观察结果显示生理盐水组线粒体嵴模糊不清，出现空泡化等破坏现象，假手术组及用药组大鼠海马细胞的线粒体嵴清晰可见。因此，从形态学上的观察结果来看，HWTX-I对脑缺血大鼠海马CA1区组织也具有神经保护作用。我们推测脑缺血后其神经保护的可能机制是通过HWTX-I作用于突触前膜的N型钙离子通道，在一定程度上有效阻碍胞外钙离子的内流，从而抑制了由于胞内钙离子聚集而激活Caspase-3、Caspase-8mRNA和蛋白表达，减轻了海马组织损伤的程度。本实验结果也提示突触前N型Ca2+通道的激活是脑缺血时钙离子内流的一个重要的原因，死亡受体凋亡通路可能在脑缺血损伤中被激动活,通过此类钙拮抗剂的应用能够达到很好的脑缺血损伤治疗作用。本实验显示随着HWTX-I神经保护作用机制的深入研究，HWTX-I可望成为临床治疗缺血性刺激引起颅脑损伤的有效药物,在运动医学领域有可能具有较好的应用前景。
4 结 论
HWTX-I蛛网膜下腔用药对全脑缺血及再灌注SD大鼠海马组织的保护作用可能通过抑制凋亡相关因子Caspase-3、Caspase-8 mRNA和蛋白表达，从而发挥其抗脑缺血再灌注损伤的保护作用。
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