【摘 要】
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为获得L-山梨糖还原酶(SR)整个操纵子序列,以pGEM-3zf(+)作为载体构建了Gluconobacter sp. S6基因文库. 结合转化子在以L-山梨糖为唯一碳源培养基上的生长情况,利用PCR技术筛
【机 构】
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中国科学院沈阳应用生态研究所,中国科学院武汉病毒所
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为获得L-山梨糖还原酶(SR)整个操纵子序列,以pGEM-3zf(+)作为载体构建了Gluconobacter sp. S6基因文库. 结合转化子在以L-山梨糖为唯一碳源培养基上的生长情况,利用PCR技术筛选到一个含L-山梨糖还原酶基因的阳性克隆pGEM-3zf(+)-sr3/E.coli,酶切鉴定插入片断长度约5.0 kb左右. 以pGEM-3zf(+)-sr3/E.coli质粒DNA为模板,扩增SR结构基因. PCR产物经测序验证为SR基因序列后,与表达载体Pet32a(+)相连,转化宿主大肠杆菌AD494(DE3)对SR基因进行表达,并利用重金属离子亲和层析技术对SR融合蛋白进行了纯化,对其酶学特性进行了研究. 结果表明:还原型辅酶II(NADPH)是SR酶蛋白的最适电子供体;SR酶蛋白的最适反应pH为7.0,pH为6.5时保持稳定,酶活力较高;最适反应温度是50 ℃,30 ℃时热稳定性较好. SDS-PAGE电泳分析,SR融合蛋白的Mr在65×103左右,由此推测出天然SR的Mr在53×103左右,与SR基因序列推测出的分子量大小一致. 图13 表2 参6
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