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【摘要】目的：建立高糖培养基诱导的HepG2细胞脂质蓄积模型，探讨益母草苷（Ajugol）对脂质代谢的影响及其可能机制。方法：将HepG2细胞分为对照组（BSA组）， BSA + Ajugol，Palmitate，Palmitate + Ajugol四组。通过油红O染色观察各组HepG2细胞体内的脂肪含量，Ad-mCherry-GFP-LC3B检测各组HepG2细胞体内的自噬变化，Western blotting法检测各组HepG2细胞体内自噬的相关蛋白表达含量。结果：Ajugol实验组中的LC3蛋白含量增多，并且ajugol实验组中的脂质有明显减少。结论：Ajugol能促进自噬减少HepG2细胞体内的脂质蓄积。
【关键词】益母草苷;脂质代谢;自噬;
【中图分类号】R29 【文献标识码】A
基金项目：国家自然科学基金资助课题（81370918）
自噬是真核细胞内的特有功能，它通过自噬体与溶酶体融合行成自噬溶酶体将细胞内破损的细胞器，错误折叠的蛋白质和脂质进行降解[1]。近年来，研究发现中药中的有效成分有减少脂质蓄积的作用，据报道熟地黄有缓解非酒精性脂肪肝的作用，但是目前不知道熟地黄中的成分ajugol是否具有缓解非酒精性脂肪肝的作用[2]。因此，通过建立HepG2细胞高脂模型，观察ajugol是否对脂肪肝产生预防作用，为临床防治脂肪肝提供新的实验依据。
1 材料与方法
1.1 细胞、主要试剂
人类肝癌细胞HepG2细胞购自American Type Culture Collection公司。BCA蛋白测定试剂盒（中国北京碧云天生物公司），P62抗体（美国Sigma公司），油红O染色液（中国北京索莱宝科技有限公司）。
1.2主要试剂配制
棕榈酸酯（Palmitate）配制如下所述，棕榈酸酯/牛血清白蛋白（BSA）耦合物是将20 mM的palmitate在0.01 M的NaOH孵育30 min以后，然后将5%无脂肪酸的BSA与palmitate以3：1的体积混合，所得到的共轭物含有5 mM的palmitate和3.75%的BSA。使用之前需用DMEM高糖培养基进行稀释。
1.3 免疫荧光
在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次。用4%的多聚甲醛固定15min接着用1%Triton X-100室温通透20min接着用PBS浸洗玻片3次，然后用BSA（1%）封闭30min。每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗，4℃孵育过夜，紧接着加荧光二抗，孵育室温2h，随后滴加DAPI避光孵育5min。用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。
1.4 Real-time
将HepG2细胞接种于6孔板中，每孔细胞数约为5×105个。培养24h待细胞贴壁后换成相应的条件培养基收集细胞，按照试剂盒提取细胞总RNA，将提取的总RNA逆转录为cDNA。反应结束后，确认Real-time PCR的扩增曲线和熔解曲线，以2-ΔCt方法计算PPARα，p62和ATG7 mRNA表达水平。
1.5 统计学分析
采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。各组HepG2细胞中LC3蛋白表达水平以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间均数两两比较采用t检验。以P=0.05为检验水准。
2 结果
2.1 各组HepG2细胞中油红O水平
油红O染色结果显示， ajugol治疗组能较明显的减少脂质在HepG2细胞上的聚集（P<0.05或P<0.01）。
2.2 各组HepG2细胞在激光共聚焦下的LC3表达水平
与BSA实验组相比，ajugol实验组能明显增强自噬体的数量，此外，palmitate + Ajugol实验组中的自噬体较Palmitate实验组的自噬体有所增加，结果表明ajugol能促进自噬（P<0.05或P<0.01）。
2.3 各组HepG2细胞中自噬相关基因的mRNA表达水平
与BSA实验组比较，ajugol组HepG2细胞中PPARα，p62和ATG7 mRNA表达水平增高（P<0.05）;与BSA + ajugol实验组相比， palmitate + ajugol实验组中的PPARα，p62和ATG7 mRNA表达水平升高（P<0.01）。
3 讨论
本研究致力于在细胞水平上探讨中药中的有效成分益母草苷对NAFLD的治疗作用及其机制。通过HepG2细胞造模， 模拟出NAFLD的细胞模型， 从油红O染色的结果可以看出， 益母草苷可显著降低细胞模型中脂滴含量。同时， 通过LC3B的免疫荧光染色检测发现，改善脂质沉积的机制与自噬有一定的相关性。本实验对自噬的相关基因P62和ATG7进行检测，发现益母草苷能较明显的增强自噬基因的表达，并且益母草苷促进PPARα基因的表达，提示益母草苷能减少脂质在HepG2细胞体内的蓄积。因此，推测益母草苷通过诱导自噬减少脂质在机体内的蓄积。
综上所述，益母草苷在增强细胞的自噬水平的同时，减少细胞内脂质沉积，说明益母草苷可能通过增强非酒精性脂肪肝细胞的自噬水平降低非酒精性脂肪肝细胞模型脂质沉积生， 因此可能对非酒精性脂肪肝具有一定的治疗效果。
參考文献：
[1]Yoomi， Chun， Joungmok et al. Autophagy： An Essential Degradation Program for Cellular Homeostasis and Life [J]. Cells， 2018.
[2]Zhang R X， Li M X， Jia Z P. Rehmannia glutinosa： review of botany， chemistry and pharmacology [J]. Journal of Ethnopharmacology， 2008， 117（2）：199-214.
【关键词】益母草苷;脂质代谢;自噬;
【中图分类号】R29 【文献标识码】A
基金项目：国家自然科学基金资助课题（81370918）
自噬是真核细胞内的特有功能，它通过自噬体与溶酶体融合行成自噬溶酶体将细胞内破损的细胞器，错误折叠的蛋白质和脂质进行降解[1]。近年来，研究发现中药中的有效成分有减少脂质蓄积的作用，据报道熟地黄有缓解非酒精性脂肪肝的作用，但是目前不知道熟地黄中的成分ajugol是否具有缓解非酒精性脂肪肝的作用[2]。因此，通过建立HepG2细胞高脂模型，观察ajugol是否对脂肪肝产生预防作用，为临床防治脂肪肝提供新的实验依据。
1 材料与方法
1.1 细胞、主要试剂
人类肝癌细胞HepG2细胞购自American Type Culture Collection公司。BCA蛋白测定试剂盒（中国北京碧云天生物公司），P62抗体（美国Sigma公司），油红O染色液（中国北京索莱宝科技有限公司）。
1.2主要试剂配制
棕榈酸酯（Palmitate）配制如下所述，棕榈酸酯/牛血清白蛋白（BSA）耦合物是将20 mM的palmitate在0.01 M的NaOH孵育30 min以后，然后将5%无脂肪酸的BSA与palmitate以3：1的体积混合，所得到的共轭物含有5 mM的palmitate和3.75%的BSA。使用之前需用DMEM高糖培养基进行稀释。
1.3 免疫荧光
在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次。用4%的多聚甲醛固定15min接着用1%Triton X-100室温通透20min接着用PBS浸洗玻片3次，然后用BSA（1%）封闭30min。每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗，4℃孵育过夜，紧接着加荧光二抗，孵育室温2h，随后滴加DAPI避光孵育5min。用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。
1.4 Real-time
将HepG2细胞接种于6孔板中，每孔细胞数约为5×105个。培养24h待细胞贴壁后换成相应的条件培养基收集细胞，按照试剂盒提取细胞总RNA，将提取的总RNA逆转录为cDNA。反应结束后，确认Real-time PCR的扩增曲线和熔解曲线，以2-ΔCt方法计算PPARα，p62和ATG7 mRNA表达水平。
1.5 统计学分析
采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。各组HepG2细胞中LC3蛋白表达水平以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间均数两两比较采用t检验。以P=0.05为检验水准。
2 结果
2.1 各组HepG2细胞中油红O水平
油红O染色结果显示， ajugol治疗组能较明显的减少脂质在HepG2细胞上的聚集（P<0.05或P<0.01）。
2.2 各组HepG2细胞在激光共聚焦下的LC3表达水平
与BSA实验组相比，ajugol实验组能明显增强自噬体的数量，此外，palmitate + Ajugol实验组中的自噬体较Palmitate实验组的自噬体有所增加，结果表明ajugol能促进自噬（P<0.05或P<0.01）。
2.3 各组HepG2细胞中自噬相关基因的mRNA表达水平
与BSA实验组比较，ajugol组HepG2细胞中PPARα，p62和ATG7 mRNA表达水平增高（P<0.05）;与BSA + ajugol实验组相比， palmitate + ajugol实验组中的PPARα，p62和ATG7 mRNA表达水平升高（P<0.01）。
3 讨论
本研究致力于在细胞水平上探讨中药中的有效成分益母草苷对NAFLD的治疗作用及其机制。通过HepG2细胞造模， 模拟出NAFLD的细胞模型， 从油红O染色的结果可以看出， 益母草苷可显著降低细胞模型中脂滴含量。同时， 通过LC3B的免疫荧光染色检测发现，改善脂质沉积的机制与自噬有一定的相关性。本实验对自噬的相关基因P62和ATG7进行检测，发现益母草苷能较明显的增强自噬基因的表达，并且益母草苷促进PPARα基因的表达，提示益母草苷能减少脂质在HepG2细胞体内的蓄积。因此，推测益母草苷通过诱导自噬减少脂质在机体内的蓄积。
综上所述，益母草苷在增强细胞的自噬水平的同时，减少细胞内脂质沉积，说明益母草苷可能通过增强非酒精性脂肪肝细胞的自噬水平降低非酒精性脂肪肝细胞模型脂质沉积生， 因此可能对非酒精性脂肪肝具有一定的治疗效果。
參考文献：
[1]Yoomi， Chun， Joungmok et al. Autophagy： An Essential Degradation Program for Cellular Homeostasis and Life [J]. Cells， 2018.
[2]Zhang R X， Li M X， Jia Z P. Rehmannia glutinosa： review of botany， chemistry and pharmacology [J]. Journal of Ethnopharmacology， 2008， 117（2）：199-214.