【摘 要】
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为探究牛病毒性腹泻病毒（BVDV）核心蛋白C激活NLRP3炎症小体诱发细胞焦亡的分子机制。本研究构建BVDV的C蛋白真核表达质粒PCMV-C，转染牛睾丸原代细胞（BT细胞），进行C蛋白的过表达。采用核因子κB（NF-κB）双荧光素酶系统检测过表达C蛋白的BT细胞中NF-κB的活性。通过荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）和蛋白质免疫印迹（WB）检测半胱氨酸蛋白酶（Caspase-1）、凋亡相关
【基金项目】
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浙江省自然科学基金重点项目（LZ23C180001）； 国家自然科学基金面上项目（32273017）； 浙江农林大学科研发展基金（2021FR034、2023LFR007）；
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为探究牛病毒性腹泻病毒（BVDV）核心蛋白C激活NLRP3炎症小体诱发细胞焦亡的分子机制。本研究构建BVDV的C蛋白真核表达质粒PCMV-C，转染牛睾丸原代细胞（BT细胞），进行C蛋白的过表达。采用核因子κB（NF-κB）双荧光素酶系统检测过表达C蛋白的BT细胞中NF-κB的活性。通过荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）和蛋白质免疫印迹（WB）检测半胱氨酸蛋白酶（Caspase-1）、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）和NLRP3等NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）炎症小体组分及白介素1β前体（pro-IL-1β）在过表达C蛋白的BT细胞中的m RNA转录水平和蛋白表达水平，并通过WB分析pro-Caspase-1和pro IL-1β的切割。通过激光共聚焦显微镜观察C蛋白与NLRP3和ASC的共定位。为进一步探究C蛋白激活NLRP3炎症小体对细胞焦亡的影响，通过qRT-PCR和WB检测过表达C细胞的BT细胞中死亡调节蛋白（GSDMD）的m RNA转录水平、蛋白表达量水平及切割情况。通过扫描电镜观察到BT细胞存在膜成孔及细胞内容物释放情况，应用ELISA检测BT细胞上清中IL-1β的分泌水平。结果显示，BT细胞过表达C蛋白之后，NF-κB被显著激活（P＜0.001）,Caspase-1、ASC和NLRP3等NLRP3炎症小体组分及pro-IL-1β的m RNA转录水平显著升高（P＜0.01）,NLRP3炎症小体组分的蛋白、pro-Caspase-1、Caspase-1 P20、pro-IL-1β和IL-1β的蛋白表达水平升高，pro-Caspase-1和pro IL-1β被切割产生Caspase-1和IL-1β。激光共聚焦显微镜观察结果显示C蛋白分别与NLRP3和ASC存在共定位。同时，BT细胞过表达C蛋白，GSDMD的m RNA转录水平显著升高（P＜0.01）,GSDMD蛋白表达量升高且被剪切成有活性的GSDMD-N和GSDMD-C。扫描电镜观察到BT细胞膜成孔，且上清中IL-1β的分泌水平显著升高（P＜0.01）。上述研究表明，C蛋白能够显著引起NLRP3炎症小体活化进而激活Caspase-1，活化的Caspase-1一方面切割GSDMD，形成有活性的GSDMD-N端并在BT细胞膜形成孔洞，释放内容物，诱导BT细胞发生细胞焦亡，另一方面活化的Caspase-1切割pro-IL-1β，形成有活性的IL-1β，并释放到BT细胞外，引起BT细胞上清中IL-1β水平上升。为进一步阐明BVDV的致病机制以及制定治疗策略提供了基础。
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