【摘 要】
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背景:卵巢颗粒细胞的过度凋亡是诱发卵巢早衰的根本途径,bcl-2基因具有抗细胞凋亡的特性.但实验表明,大鼠bcl-2基因序列中鸟嘌呤与胞嘧啶含量高达60.6%,应用常规聚合酶链反应
【机 构】
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南方医科大学附属珠江医院妇产科,广东省广州市,510282
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背景:卵巢颗粒细胞的过度凋亡是诱发卵巢早衰的根本途径,bcl-2基因具有抗细胞凋亡的特性.但实验表明,大鼠bcl-2基因序列中鸟嘌呤与胞嘧啶含量高达60.6%,应用常规聚合酶链反应方法,无法扩增出此基因.目的:拟克隆大鼠基凶组中高鸟嘌呤与胞嘧啶含量的bcl-2基凶编码序列.设计、时间及地点:开放性实验,于2007-05/12在中山大学生命科学院医药分子生物学实验室完成.材料:Wistar大鼠购自中山大学实验动物中心生产供应部,大肠杆菌DH5 α由中山大学分子医药生物学实验室保种,载体pMD18-T购自TakaRa大连宝生物技术公司.方法:采用改进的反转录一聚合酶链反应方法从大鼠脾脏组织中扩增出鸟嘌呤与胞嘧啶含量为60.6%的bcl/-2 cDNA编码序列,将扩增产物克隆至pMD18-T载体中,用单菌活聚合酶链反应扩增快速鉴定DNA片段后进行序列分析.主要观察指标:①大鼠bcl-2基因cDNA克隆与纯化.②bcl-2基因cDNA与pMD18-T载体的连接、转化、鉴定阳性克隆及测序结果.结果:在筛选的阳性克隆中扩增到大鼠bcl-2基因,DNA序列分析结果与Genebank中序列相比,同源性为99%.结论:高鸟嘌呤与胞啼啶含量基因的扩增属于困难聚合酶链反应,实验采用改进技术成功克隆了大鼠bcl-2基因,此技术也适用于其他富含鸟嘌呤与胞嘧啶的基因快速扩增.
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