【摘 要】
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【目的】对华南地区分离到的1株H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus, AIV）流行株NP蛋白进行原核表达，制备H9N2亚型AIV NP蛋白多克隆抗体。【方法】将1株H9N2亚型AIV的NP基因克隆至pET-32a（+）原核表达载体，构建NP蛋白原核表达质粒。将重组质粒同时转化大肠杆菌BL21（DE3）和Rosetta（DE3）感受态细胞，经IPTG诱导表达重组蛋白。通
【机 构】
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佛山科学技术学院生命科学与工程学院
【基金项目】
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国家自然科学基金（32002320）； 广东省基础与应用基础研究基金（2020A1515010116、2214050006730）； 佛山科学技术学院研究生自由探索基金（2021ZYTS24）；
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【目的】对华南地区分离到的1株H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus, AIV）流行株NP蛋白进行原核表达，制备H9N2亚型AIV NP蛋白多克隆抗体。【方法】将1株H9N2亚型AIV的NP基因克隆至pET-32a（+）原核表达载体，构建NP蛋白原核表达质粒。将重组质粒同时转化大肠杆菌BL21（DE3）和Rosetta（DE3）感受态细胞，经IPTG诱导表达重组蛋白。通过考马斯亮蓝染色和Western blotting分析并比较NP蛋白在两种表达菌中的表达量，进一步优化诱导剂浓度、诱导时间及诱导温度等条件，提高蛋白的表达效率。采用镍柱亲和层析法对NP蛋白进行纯化，用BCA法测定蛋白浓度。以纯化的NP蛋白免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体，通过Western blotting和间接免疫荧光对所制备的多克隆抗体进行鉴定，通过间接ELISA测定抗体效价。【结果】试验成功构建pET-32a-H9N2-NP原核表达质粒并表达重组NP蛋白。考马斯亮蓝染色和Western blotting结果均表明，重组NP蛋白在大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞中表达水平远高于大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，其大小约73 ku。诱导条件优化结果显示，重组NP蛋白在37℃、IPTG终浓度为1 mmol/L诱导7 h时的表达量最大，且通过镍柱纯化后得到纯度较高的重组蛋白。Western blotting和间接免疫荧光结果均表明，所制备的多克隆抗体能高效地与H9N2亚型AIV发生特异性结合。间接ELISA测得多克隆抗体的效价为1∶409 600。【结论】本研究制备的兔抗NP蛋白多克隆抗体效价较高，表明NP蛋白具有良好的免疫原性，为今后NP蛋白单克隆抗体的制备和ELISA检测方法的建立奠定了基础。
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