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[摘要]目的：观察不同时期大鼠眼轮匝肌失神经支配后肌细胞直径与酶含量的变化，为临床面神经损伤最佳手术修复时机提供理论依据。方法：建立面神经损伤大鼠模型，应用计算机图像分析仪及比色分析技术，分别观察面神经离断术后第1、3天,第1、2、4、6、8周眼轮匝肌肌细胞直径和Ca2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶含量的变化。结果：面神经离断术后眼轮匝肌肌细胞直径从正常值降到只占正常值的20%；Ca2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶的灰度值亦分别从术后1天的（1.24±0.17）、（8.55±0.36）增加到术后8周的（1.42±0.10）、（9.74±0.33），差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：大鼠面神经离断术后眼轮匝肌肌细胞直径、Ca2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶含量下降，并且随失神经支配时间延长呈进行性下降，提示面神经损伤修复手术应早期进行，有利于面神经功能恢复。
[关键词]失神经支配；不可逆肌萎缩；肌细胞；Ca2+-ATP酶；Na+-K+-ATP酶
[中图分类号]R332 Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2012）03-0422-02
Study on the the diameter and enzyme content changes of muscle cells lack of facial-nerve innnervation at different periods
YU Rui-fang1,ZHANG Bao-lin2,WANG Feng1,FENG Rui-zheng2
(1.Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,Shanxi,China;2.Department of Plastic Surgery,The First Affiliated Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,Shanxi,China)
Abstract: Objective We aimed at the rats orbicularis oculi muscle cell diameter and enzyme content changes at different periods of facial-nerve denervation in order to provide a theoretical basis for the best timing of facial-nerve surgical repair. Methods Rat models of facial nerve injury at different periods (1d, 3d, 1w, 2w, 4w, 6w, 8w) were made and the changes of orbicularis oculi muscle cell diameter and the Ca2+-atpases, Na+-K+-atpases content were observed by computer image analyzer and colorimetric analysis at different denervation periods. Results After facial nerve denervation, the diameter of muscle cell decreased to 20% of normal amount, and the grey level of Ca2+-atpases, Na+-K+-atpases increased from the first day after surgery（1.24±0.17）,（8.55±0.36）to the eighth week（1.42±0.10）,（9.74±0.33）. The differences were statistically significant（P<0.05）. Conclusion The muscle cell diameter,the Ca2+-atpases and Na+-K+-atpases content decreased after facial-nerve denervation and have a progressive decline with the time extension, which suggests that early facial-nerve surgical repair benefits to the recovery of facial nerve function most.
Key words: Denervation;Irreversible muscle atrophy;Muscle cell;Ca2+-atpases; Na+- K+-atpases
近年来，各种原因导致的失面神经瘫痪发病率日益增加，例如外伤、医源性损伤、肿瘤等[1]。我国现有面瘫、面肌痉挛人群已达到6 200万,一般急性面瘫仅有6.1%的人群得到及时治疗。所以面部表情肌萎缩机制逐步得到了研究者的重视[2]，但是目前国内尚未见到关于面部表情肌失神经支配后在不可逆萎缩时间程度上的相关报道。因此，我们建立了不同时期面神经离断的动物模型，应用计算机图像分析仪和比色分析技术分别观察术后不同时期眼轮匝肌肌细胞直径、Ca2+-ATP酶和Na+-K+-ATP酶含量的变化，以期初步探讨大鼠眼轮匝肌不同时期失面神经后肌细胞直径与酶含量的变化规律，为临床面神经损伤最佳手术修复时机提供一定的理论依据。
1 材料和方法
1.1 实验动物模型制作 选用体重200～250g的健康SD大鼠70只[3], 随机分成7个实验组，每组10只，实验组为面神经（右侧）离断后第1、3天、第1、2、4、6、8周的眼轮匝肌,正常对照组为各实验组中面神经非离断侧（左侧）的眼轮匝肌。10%水合氯醛30mg/kg腹腔内注射麻醉后,左侧卧位固定，脱毛。沿大鼠右耳廓后缘作弧形切口，解剖面神经于出茎乳孔出口0.5cm处，离断面神经[4]。
1.2 肌细胞标本的制备 分别于术后不同时期处死大鼠，迅速取下双侧眼轮匝肌，取部分肌肉组织置于2%多聚甲醛4℃固定60min，石蜡包埋标本，按5μm厚度系列切片, 每三张连续切片为一组，进行HE染色，用计算机图像分析仪测定肌细胞直径。
1.3 酶组织化学标本制备 另取部分肌肉组织做冰冻切片，分别置于Ca2+-ATPP酶孵育液和Na+-K+-ATP酶孵育液（试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供），37℃水浴反应10min、离心、定磷；比色法检测上述两种酶的灰度值（即实际含量的倒数，数值越小，含量越高）。
1.4 统计学分析 全部数据经SPSS16.0软件包进行统计分析，所有定量资料均以x±s表示，对所得数据进行组间均数t检验，P<0.05有统计学意义。
2 结果
2.1 失面神经支配后肌细胞直径的变化 失神经支配术后1、3天组眼轮匝肌肌细胞直径变化不明显，术后1周组, 肌细胞直径减少约25%,术后2周组, 肌细胞直径减少约35%,术后4周组,肌细胞直径减少近45%,术后6周组, 肌细胞直径减少近60%，至失面神经支配第8周, 肌细胞直径只占正常值的20%。肌细胞直径在监测期内随失面神经支配时间延长呈进行性下降。
2.2 失面神经支配后酶组织化学的变化 面神经离断术后1、3天组,左侧（面神经非离断侧）与右侧（面神经离断侧）Ca2+-ATP酶的灰度值、Na+-K+-ATP酶的灰度值变化不明显,无明显差异（P>0.05）；术后1、2、4、6、8周组左侧与右侧Ca2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶的灰度值有差异（P<0.05），并且随失面神经时间的延长呈进行性增高趋势（酶的灰度值即其实际含量的倒数，数值越小，含量越高）。详见表1。
3 讨论
3.1 大鼠眼轮匝肌受单侧面神经支配，主要由快缩纤维即白肌构成。面神经是以运动为主的混合神经[5]。眼轮匝肌失面神经支配后，在形态学上首先表现为肌细胞胞浆丢失及直径减小[6]。我们研究发现, 在监测期内肌细胞直径随失面神经支配时间延长呈进行性下降（P<0.05）,可作为反映肌肉萎缩的可靠形态学指标。
3.2 Ca2+-ATP酶又称Ca2+泵，是一种Ca2+-Mg2+依赖式ATP酶,主要存在于骨骼肌肌浆网膜上,其活性强弱可以反映该肌的功能状态。面神经离断后,由于内流阻滞, 神经营养物质逐渐耗尽[7],肌纤维蛋白质合成减少,最终Ca2+泵活性减弱,表现为眼轮匝肌酶活性减弱[8]。我们研究发现，面神经离断时间越长,眼轮匝肌 Ca2+-ATP酶活性损伤越重,该肌的生物学作用减弱越明显，所以我们认为面部表情肌肌纤维钙泵的活性变化可以反映该肌肌纤维的生物学作用。
3.3 Na+-K+-ATP酶活性的强弱反应氧化代谢的强弱和能量供应程度[9]。人体骨骼肌失神经支配后Na+-K+-ATP酶活性丧失可能是不可逆肌萎缩的重要原因之一[10]。我们研究发现，失神经支配后的面部表情肌中Na+-K+-ATP酶含量下降，而且随着失神经时间的延长呈进行性下降趋势，所以我们认为Na+-K+-ATP酶活性也是可靠的酶组织化学指标。
综上所述，失面神经支配后,眼轮匝肌肌细胞直径、Ca2+泵、Na+泵活性下降，并且随失面神经支配时间延长呈进行性下降趋势,表现为肌肉萎缩、酶活性减弱；面神经离断时间越长,肌肉萎缩越明显，酶活性损伤也越重，不利于最终面神经功能的恢复。所以，面神经损伤后，及时观察肌肉萎缩程度，监测Ca2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶含量，早期进行神经修复手术有利于面神经功能恢复。
[参考文献]
[1]刘国栋,张荣明.面神经损伤修复方法的研究进展[J].中国美容医学,2010,19(9):14019-1411.
[2]MayaG.Sardesai,Kris.S.Moe.Recent progress in facial paralysis: advances and obstacles[J].Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery, 2010,18:266-271.
[3]牛宇.胡敏.面神经缺损修复动物模型的应用[J].实验动物科学,2007,24(1):41-43.
[4]Moran LB,Graeber MB..Facial nerve axotomy model[J]. Brain Res Rev, 2004,44:154-178.
[5]江文博,许为青.面神经损伤修复的方法[J].安徽医药,2009,13(12):1568-1569.
[6]肖苒,俞光岩,蔡志刚,等.单侧面肌失神经支配后组织病理学改变的观察[J].中华口腔医学杂志,2001，36(3):177.
[7]曹志伟,柳斌,李笑天,等. 面神经失神经支配面肌间酶活性差异的实验研究[J].山东大学基础医学院学报,2005,19(4):221-223.
[8]石阳,任重.实验性面神经麻痹面肌Ca2+ATP 酶活性观察[J].山东医大基础医学院学报,2000,14(6):321-322.
[9]王奕,张淑红,罗佳滨,等.骨骼肌纤维型和运动终板的酶组织化学研究[J].黑龙江医药科,2006,29(1):51-52.
[10]Sertac Yetiser, Erkan Kahraman. Analysis of Time-Dependent Changes of Neurotrophic Factors (BDNF, CNTF) in Traumatic Facial Nerve Injury of a Nerve-Cut and Nerve-Crush Model in Rats[J]. Otology & Neurotology,2008,29: 393-396.
[收稿日期]2011-10-13 [修回日期]2012-01-10
编辑/张惠娟
[关键词]失神经支配；不可逆肌萎缩；肌细胞；Ca2+-ATP酶；Na+-K+-ATP酶
[中图分类号]R332 Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2012）03-0422-02
Study on the the diameter and enzyme content changes of muscle cells lack of facial-nerve innnervation at different periods
YU Rui-fang1,ZHANG Bao-lin2,WANG Feng1,FENG Rui-zheng2
(1.Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,Shanxi,China;2.Department of Plastic Surgery,The First Affiliated Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,Shanxi,China)
Abstract: Objective We aimed at the rats orbicularis oculi muscle cell diameter and enzyme content changes at different periods of facial-nerve denervation in order to provide a theoretical basis for the best timing of facial-nerve surgical repair. Methods Rat models of facial nerve injury at different periods (1d, 3d, 1w, 2w, 4w, 6w, 8w) were made and the changes of orbicularis oculi muscle cell diameter and the Ca2+-atpases, Na+-K+-atpases content were observed by computer image analyzer and colorimetric analysis at different denervation periods. Results After facial nerve denervation, the diameter of muscle cell decreased to 20% of normal amount, and the grey level of Ca2+-atpases, Na+-K+-atpases increased from the first day after surgery（1.24±0.17）,（8.55±0.36）to the eighth week（1.42±0.10）,（9.74±0.33）. The differences were statistically significant（P<0.05）. Conclusion The muscle cell diameter,the Ca2+-atpases and Na+-K+-atpases content decreased after facial-nerve denervation and have a progressive decline with the time extension, which suggests that early facial-nerve surgical repair benefits to the recovery of facial nerve function most.
Key words: Denervation;Irreversible muscle atrophy;Muscle cell;Ca2+-atpases; Na+- K+-atpases
近年来，各种原因导致的失面神经瘫痪发病率日益增加，例如外伤、医源性损伤、肿瘤等[1]。我国现有面瘫、面肌痉挛人群已达到6 200万,一般急性面瘫仅有6.1%的人群得到及时治疗。所以面部表情肌萎缩机制逐步得到了研究者的重视[2]，但是目前国内尚未见到关于面部表情肌失神经支配后在不可逆萎缩时间程度上的相关报道。因此，我们建立了不同时期面神经离断的动物模型，应用计算机图像分析仪和比色分析技术分别观察术后不同时期眼轮匝肌肌细胞直径、Ca2+-ATP酶和Na+-K+-ATP酶含量的变化，以期初步探讨大鼠眼轮匝肌不同时期失面神经后肌细胞直径与酶含量的变化规律，为临床面神经损伤最佳手术修复时机提供一定的理论依据。
1 材料和方法
1.1 实验动物模型制作 选用体重200～250g的健康SD大鼠70只[3], 随机分成7个实验组，每组10只，实验组为面神经（右侧）离断后第1、3天、第1、2、4、6、8周的眼轮匝肌,正常对照组为各实验组中面神经非离断侧（左侧）的眼轮匝肌。10%水合氯醛30mg/kg腹腔内注射麻醉后,左侧卧位固定，脱毛。沿大鼠右耳廓后缘作弧形切口，解剖面神经于出茎乳孔出口0.5cm处，离断面神经[4]。
1.2 肌细胞标本的制备 分别于术后不同时期处死大鼠，迅速取下双侧眼轮匝肌，取部分肌肉组织置于2%多聚甲醛4℃固定60min，石蜡包埋标本，按5μm厚度系列切片, 每三张连续切片为一组，进行HE染色，用计算机图像分析仪测定肌细胞直径。
1.3 酶组织化学标本制备 另取部分肌肉组织做冰冻切片，分别置于Ca2+-ATPP酶孵育液和Na+-K+-ATP酶孵育液（试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供），37℃水浴反应10min、离心、定磷；比色法检测上述两种酶的灰度值（即实际含量的倒数，数值越小，含量越高）。
1.4 统计学分析 全部数据经SPSS16.0软件包进行统计分析，所有定量资料均以x±s表示，对所得数据进行组间均数t检验，P<0.05有统计学意义。
2 结果
2.1 失面神经支配后肌细胞直径的变化 失神经支配术后1、3天组眼轮匝肌肌细胞直径变化不明显，术后1周组, 肌细胞直径减少约25%,术后2周组, 肌细胞直径减少约35%,术后4周组,肌细胞直径减少近45%,术后6周组, 肌细胞直径减少近60%，至失面神经支配第8周, 肌细胞直径只占正常值的20%。肌细胞直径在监测期内随失面神经支配时间延长呈进行性下降。
2.2 失面神经支配后酶组织化学的变化 面神经离断术后1、3天组,左侧（面神经非离断侧）与右侧（面神经离断侧）Ca2+-ATP酶的灰度值、Na+-K+-ATP酶的灰度值变化不明显,无明显差异（P>0.05）；术后1、2、4、6、8周组左侧与右侧Ca2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶的灰度值有差异（P<0.05），并且随失面神经时间的延长呈进行性增高趋势（酶的灰度值即其实际含量的倒数，数值越小，含量越高）。详见表1。
3 讨论
3.1 大鼠眼轮匝肌受单侧面神经支配，主要由快缩纤维即白肌构成。面神经是以运动为主的混合神经[5]。眼轮匝肌失面神经支配后，在形态学上首先表现为肌细胞胞浆丢失及直径减小[6]。我们研究发现, 在监测期内肌细胞直径随失面神经支配时间延长呈进行性下降（P<0.05）,可作为反映肌肉萎缩的可靠形态学指标。
3.2 Ca2+-ATP酶又称Ca2+泵，是一种Ca2+-Mg2+依赖式ATP酶,主要存在于骨骼肌肌浆网膜上,其活性强弱可以反映该肌的功能状态。面神经离断后,由于内流阻滞, 神经营养物质逐渐耗尽[7],肌纤维蛋白质合成减少,最终Ca2+泵活性减弱,表现为眼轮匝肌酶活性减弱[8]。我们研究发现，面神经离断时间越长,眼轮匝肌 Ca2+-ATP酶活性损伤越重,该肌的生物学作用减弱越明显，所以我们认为面部表情肌肌纤维钙泵的活性变化可以反映该肌肌纤维的生物学作用。
3.3 Na+-K+-ATP酶活性的强弱反应氧化代谢的强弱和能量供应程度[9]。人体骨骼肌失神经支配后Na+-K+-ATP酶活性丧失可能是不可逆肌萎缩的重要原因之一[10]。我们研究发现，失神经支配后的面部表情肌中Na+-K+-ATP酶含量下降，而且随着失神经时间的延长呈进行性下降趋势，所以我们认为Na+-K+-ATP酶活性也是可靠的酶组织化学指标。
综上所述，失面神经支配后,眼轮匝肌肌细胞直径、Ca2+泵、Na+泵活性下降，并且随失面神经支配时间延长呈进行性下降趋势,表现为肌肉萎缩、酶活性减弱；面神经离断时间越长,肌肉萎缩越明显，酶活性损伤也越重，不利于最终面神经功能的恢复。所以，面神经损伤后，及时观察肌肉萎缩程度，监测Ca2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶含量，早期进行神经修复手术有利于面神经功能恢复。
[参考文献]
[1]刘国栋,张荣明.面神经损伤修复方法的研究进展[J].中国美容医学,2010,19(9):14019-1411.
[2]MayaG.Sardesai,Kris.S.Moe.Recent progress in facial paralysis: advances and obstacles[J].Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery, 2010,18:266-271.
[3]牛宇.胡敏.面神经缺损修复动物模型的应用[J].实验动物科学,2007,24(1):41-43.
[4]Moran LB,Graeber MB..Facial nerve axotomy model[J]. Brain Res Rev, 2004,44:154-178.
[5]江文博,许为青.面神经损伤修复的方法[J].安徽医药,2009,13(12):1568-1569.
[6]肖苒,俞光岩,蔡志刚,等.单侧面肌失神经支配后组织病理学改变的观察[J].中华口腔医学杂志,2001，36(3):177.
[7]曹志伟,柳斌,李笑天,等. 面神经失神经支配面肌间酶活性差异的实验研究[J].山东大学基础医学院学报,2005,19(4):221-223.
[8]石阳,任重.实验性面神经麻痹面肌Ca2+ATP 酶活性观察[J].山东医大基础医学院学报,2000,14(6):321-322.
[9]王奕,张淑红,罗佳滨,等.骨骼肌纤维型和运动终板的酶组织化学研究[J].黑龙江医药科,2006,29(1):51-52.
[10]Sertac Yetiser, Erkan Kahraman. Analysis of Time-Dependent Changes of Neurotrophic Factors (BDNF, CNTF) in Traumatic Facial Nerve Injury of a Nerve-Cut and Nerve-Crush Model in Rats[J]. Otology & Neurotology,2008,29: 393-396.
[收稿日期]2011-10-13 [修回日期]2012-01-10
编辑/张惠娟