蛋白激酶C α mRNA在低氧猪肺动脉平滑肌细胞的表达及对细胞增殖的作用

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我们最近发现蛋白激酶C(PKC)参与正常肺血管张力的调控[1,2];低氧可使肺动脉PKC蛋白水平表达增高[3],且可使PKC对肺血管张力的调控作用明显增强[4]。但有关低氧对肺动脉平滑肌细胞(PASMC)在mRNA转录水平表达的影响以及PKC对PASMC增殖的影响的研究报道尚较少见,我们对此进行探讨。 材料与方法取幼年猪肺动脉主干,刮去内皮细胞,将中膜肌层切割成小组织块,接种在培养瓶内,待贴壁后,加入含10%胎牛血清的M199液,置37℃,CO2培养箱内培养。生长融合的PASMC以1∶1的0.25%胰蛋白酶和0.04%乙二胺四乙酸(EDTA)混合消化,按1∶2分装、接种。根据细胞生长呈典型的“峰与谷”结构及免疫荧光α平滑肌肌动蛋白(α-SM actin)阳性鉴定为平滑肌细胞。取3~5代,在5%氧浓度下分别培养0、1、24、48和72 h。 斑点杂交方法:按TRIzol试剂盒要求用一步法提取总RNA,校正各组RNA浓度为1 μg/ μl。每组取10 μl 样本,用96孔点样器点膜,按试剂盒说明进行预杂交和杂交。cDNA探针由载有兔PKC-α cDNA片段的质粒(日本横滨市立大学医学部大野茂男教授馈赠)经PCR扩增为307 bp片段,用地高辛试剂盒标记。结果用TJTY-300型全自动图像分析仪进行分析。

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