目的:基于ITS2序列对中药材王不留行种子及其混伪品进行鉴定研究,为王不留行种子及其混伪品的鉴定提供新方法。方法:对王不留行种子及其混伪品样品提取基因组DNA、PCR扩增、双向测序获得ITS2序列。应用MEGA 6.0软件计算种内、种间遗传距离,构建邻接树,基于自行编写的代码和开源代码PHP QR Code的编码方式,将王不留行及其混伪品ITS2序列转换为条形码图片,获得各物种二维DNA条形码图片,并在中药材DNA条形码鉴定系统(www.tcmbarcode.cn)对所获得ITS2序列进行分析鉴定。结果:王不留行药材ITS2序列长度为219-221 bp,种内最大K2P遗传距离为0.009,小于其与混伪品的种间K2P遗传距离,王不留行及其混伪品ITS2序列间存在的变异位点较多。NJ树结果表明王不留行与其混伪品分别聚为一支,可明显区分。结论:ITS2序列可以准确鉴别王不留行种子,为其种质资源鉴定和中药材种子质量标准的建立提供了新方法,将获得的ITS2序列转换为二维DNA条形码可为王不留行药材流通管理提供便利,为保障王不留行临床用药安全提供了新的技术手段。