【摘 要】
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目的为探讨S1P2受体介导血管内皮细胞衰老的机制,构建和筛选特异性S1P2受体shRNA腺病毒载体。方法设计并合成4对靶向S1P2受体的单链寡核苷酸(ssoligo),经变性退火为双链寡核
【机 构】
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中南大学湘雅三医院医学实验中心,中南大学生物科学与技术学院生物化学教研室
【基金项目】
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国家自然科学基金资助课题(30872709)
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目的为探讨S1P2受体介导血管内皮细胞衰老的机制,构建和筛选特异性S1P2受体shRNA腺病毒载体。方法设计并合成4对靶向S1P2受体的单链寡核苷酸(ssoligo),经变性退火为双链寡核苷酸(dsoligo)插入穿梭质粒pRNAT-H1.1/Shuttle载体,测序正确后经脂质体介导转染人肺动脉内皮细胞(HPAEC),通过RT-PCR方法筛选对S1P2受体基因沉默效果最佳的穿梭质粒pRNAT-H1.1/Shuttle-shRNA,提取质粒DNA,经双酶切,回收S1P2受体基因沉默效果最佳的shRNA片段,亚克隆到腺病毒表达载体(pAdeno-X),筛选出正确重组子,转染HEK293A细胞,收集重组的腺病毒,测定病毒滴度,通过Westernblot方法检测S1P2受体沉默效果。结果测序结果证实所构建的pRNAT-H1.1/Shuttle-shRNA质粒正确,并从4对dsoligos筛选出对S1P2受体沉默效果最佳的穿梭质粒pRNAT-H1.1/Shuttle-shRNA,经亚克隆到腺病毒表达载体。转染人肺动脉内皮细胞后,Western印迹检测显示构建的腺病毒载体pAdeno-shRNA对S1P2受体蛋白的沉默有明显效果。结论成功地构建和筛选出介导特异性shRNA-S1P2的重组腺病毒。
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