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【摘 要】对桉树在组培生产过程中出现褐化、玻璃化、污染等问题进行分析与提出解决方法。
【关键词】桉树组培苗褐化玻璃化污染解决方法
桉树是世界上主要产材的三大树种之一，其人工林占世界人工林的五分之一，是我国南方主要树种；桉属树种较多，有性杂交容易，但难保持优树特性，无性繁殖遗传性状稳定，目前桉树繁殖技术虽然日趋成熟，但在组培过程中常会出现许多问题，迫切需要解决，现就桉树组培苗在生产过程中出现的褐化、玻璃化、污染等问题发生原因归纳如下，并提出解决方法：
一、外植体以及增殖材料的褐化问题。
1.发生原因。
1.1选用DH3229、广林九、雷林九、广州1号、杂交桉u6等品种取幼嫩茎段进行试验对比，品种之间差异很大，外植体材料中单宁类和多酚类化合物含量高的品种易引起褐化。如DH3229、广林九、雷林九等褐化率高，而广州1号、杂交桉u6褐化率低。
1.2外植体的采集部位及切割面积与褐化相关。
通常是幼嫩部位产生褐化较轻，组织越老熟而褐化越重，切割面越大，褐化越重。
1.3外植体的取样时间及季节与褐化相关。
1.4在初级培养阶段，选择培养基成分中无机盐成分，蔗糖浓渡、激素浓度、PH值对防止褐化有影响作用。
1.5外植体的消毒剂种类、浓度及消毒时间和清洗程度对影响褐化起关键作用。
1.6初代培养的方式：温度调控、光照强度等因素不当容易引起褐化。
2.解决方法
2.1对较易产生褐化的品种，在接种的培养基里适量加入抗氧化剂和抑制剂，如抗坏血酸、柠檬酸、半胱氨酸、活性碳等。
2.2根据前人研究结果和笔者的多次试验，桉树外植体的采集材料是控制褐化的关键，在采集枝条之前先对母株或枝条进行喷施杀虫剂和杀菌剂，五天后用黑塑料袋套住需采枝条遮光处理5天左右，经预处理有助于减轻褐化，外植体材料以幼嫩的带芽茎段，长度1.5cm单芽最适宜，这样大大减少褐化率。
2.3外植体的采集时间及季节对减少褐化非常重要，大部分易褐化种源随着生长季节褐化率逐渐上升，在5、6、7、8月份达到高峰，然后又从9月份开始逐渐下降，从11月份至次年2月份取材褐化率最低。
2.4桉树在初代培养阶段大量元素和外源激素敀浓度增大会造成褐化加重，蔗糖浓度2%—3%。PH值为5.6—5.8，B5培养基铁盐较低较为适应桉树初代组培。
2.5选用适当消毒剂、消毒浓度和消毒时间。常用消毒剂有0.1%升汞、0.3%次氯酸钠和70%酒精。消毒时间：0.1%升汞7—9分钟，0.3%次氯酸钠15分钟，70%酒精低于10秒，每次消毒需多次用无菌水冲洗。消毒时间越长灭菌越彻底，但褐化也越严重，消毒时间过短，杀菌不彻底，因此要正确选择消毒浓度和消毒时间，才能保证较高的外植体存活。
2.6对褐化严重的品种，外植体接种后经过全暗培养10—15天后逐渐增加到1500—2000Lx光照培养，温度从低温到高温，温度16—24℃为宜，不能长期低温培养。
二、组培苗玻璃化问题
在桉树组培时经常会发现组培苗叶、嫩梢呈水晶透明或水浸状，整株矮小或高出，失绿、脆弱易碎，叶表缺少角质层蜡质，没有功能气孔，仅有海绵组织是一种生理失调或病变，在组织培养中危害相当严重，也是亟待解决的问题。
1.发生原因
1.1琼脂硬度和蔗糖浓度与玻璃化成负相关。
1.2 6BA浓度和培养室温度与玻璃化成正相关。
1.3玻璃化是培养瓶内气体与外界交换不畅有关，密闭的封瓶口材料是导致玻璃化的原因之一。
1.4培养基中高的含N量，特别是高的氨态N，也是导致玻璃化的因素之一。
2.解决方法：
2.1利用固体培养基，增加琼脂或卡拉胶浓度,降低培养基的衬质势，促使细胞吸水阻遏，适当提高蔗糖含量或加入渗透剂，降低培养基中的渗透势，降低培养容器内部环境的相对湿度。
2.2适当调低6—BA和GA3的浓底，适量加入IAA和活性碳。
2.3控制温度低温处理，温度不超过32℃,在昼夜变温交替的情况下比恒温效果好，温度过高、生长过快，玻璃苗增多。
2.4增加自然光照，光强控制在1500—3000LX，每天光照12—14小时，试验发现玻璃苗放置于自然光下几天后，茎、叶变红，玻璃化逐渐消失，自然光中紫外线能促进组培苗成熟，加快木质化。
2.5增加Ca 、 Mg 、 M n 、 K 、P 、 Fe元素含量，降低N和CL元素比例，特别降低氨态氮浓度，适当提高硝态氮含量。
2.6改善培养器的通风换气条件，如用棉塞或塑料胶盖子。
2.7用40℃热击处理愈伤组织培养物会降低内源细胞分裂素水平，可消除再生苗的玻璃化。
三、污染问题
桉树组培苗工厂化生产在我国南方发展较快，快繁技术日趋成熟，但组培苗污染率较高，造成经济损失较大，因此如何克服污染问题是不可忽视的技术环节。
1.主要原因
污染一般分为真菌污染和细菌污染，其来源可分为三大类；材料带菌污染、操作不当污染、培养过程感染；细菌污染分外生细菌污染和内生细菌污染，外生细菌污染多数是培养基消毒不合格、接种工具、接种人员操作不当而引起，而内生细菌污染多数是接种材料本身带菌。真菌污染主要来自环境条件。
2.解决方法
2.1改善环境条件，接种室与培养室、缓冲间要定期用高锰酸钾和甲醛薰蒸消毒，每次接种前接种室及工作台要开紫外灯30分钟以上，工作台启动吹风15分钟后才使用，定期（一个月）开紫外灯消毒培养室1-小时，培养室相对湿度控制在70%左右。
2.2定期培训接种人员，严格遵守操作规程，对接种所需工具要严格灭菌后才能使用，工作台内不要堆放过多待用材料，专人负责检验材料是否带菌，淘汰被污染的材料。
2.3经常检查消毒锅的灭菌质量，消毒出锅的培养基用白纱布盖实，让其缓慢冷却，避免外界冷空气倒吸入已灭菌的培养瓶内引起真菌污染。
2.4采用反复茎尖培养的方法脱除桉树组培材料的内生细菌。
2.5对外植体的消毒要正确选用表面消毒剂、消毒浓度和消毒时间。桉树外植体带芽茎段带菌少且易灭菌，繁殖快，大量试验表明：0.1%升汞灭菌7-9分钟是最理想的消毒浓度和消毒时间。根据不同的接种材料，选择消毒剂、消毒浓度和消毒时间也有所不同，需经多次实践摸索，才能找出最佳操作方案。
2.6在培养基中适量加入过滤灭菌后的抗生素如：青霉素GK、链霉素、庆大霉素等有效抑制内生菌的生长。
参考文献：
[1]欧阳磊，桉树组培快繁存在的问题与对策（J）福建林业科技2006、203-206.
[2]曹孜义、刘国民，实用植物组织培养技术教程（M）兰州，甘肃科学技术出版社1996.1-8.
[3]张远华等尾赤桉组培繁殖技术研究（J）广西科技第2008第1期.
【关键词】桉树组培苗褐化玻璃化污染解决方法
桉树是世界上主要产材的三大树种之一，其人工林占世界人工林的五分之一，是我国南方主要树种；桉属树种较多，有性杂交容易，但难保持优树特性，无性繁殖遗传性状稳定，目前桉树繁殖技术虽然日趋成熟，但在组培过程中常会出现许多问题，迫切需要解决，现就桉树组培苗在生产过程中出现的褐化、玻璃化、污染等问题发生原因归纳如下，并提出解决方法：
一、外植体以及增殖材料的褐化问题。
1.发生原因。
1.1选用DH3229、广林九、雷林九、广州1号、杂交桉u6等品种取幼嫩茎段进行试验对比，品种之间差异很大，外植体材料中单宁类和多酚类化合物含量高的品种易引起褐化。如DH3229、广林九、雷林九等褐化率高，而广州1号、杂交桉u6褐化率低。
1.2外植体的采集部位及切割面积与褐化相关。
通常是幼嫩部位产生褐化较轻，组织越老熟而褐化越重，切割面越大，褐化越重。
1.3外植体的取样时间及季节与褐化相关。
1.4在初级培养阶段，选择培养基成分中无机盐成分，蔗糖浓渡、激素浓度、PH值对防止褐化有影响作用。
1.5外植体的消毒剂种类、浓度及消毒时间和清洗程度对影响褐化起关键作用。
1.6初代培养的方式：温度调控、光照强度等因素不当容易引起褐化。
2.解决方法
2.1对较易产生褐化的品种，在接种的培养基里适量加入抗氧化剂和抑制剂，如抗坏血酸、柠檬酸、半胱氨酸、活性碳等。
2.2根据前人研究结果和笔者的多次试验，桉树外植体的采集材料是控制褐化的关键，在采集枝条之前先对母株或枝条进行喷施杀虫剂和杀菌剂，五天后用黑塑料袋套住需采枝条遮光处理5天左右，经预处理有助于减轻褐化，外植体材料以幼嫩的带芽茎段，长度1.5cm单芽最适宜，这样大大减少褐化率。
2.3外植体的采集时间及季节对减少褐化非常重要，大部分易褐化种源随着生长季节褐化率逐渐上升，在5、6、7、8月份达到高峰，然后又从9月份开始逐渐下降，从11月份至次年2月份取材褐化率最低。
2.4桉树在初代培养阶段大量元素和外源激素敀浓度增大会造成褐化加重，蔗糖浓度2%—3%。PH值为5.6—5.8，B5培养基铁盐较低较为适应桉树初代组培。
2.5选用适当消毒剂、消毒浓度和消毒时间。常用消毒剂有0.1%升汞、0.3%次氯酸钠和70%酒精。消毒时间：0.1%升汞7—9分钟，0.3%次氯酸钠15分钟，70%酒精低于10秒，每次消毒需多次用无菌水冲洗。消毒时间越长灭菌越彻底，但褐化也越严重，消毒时间过短，杀菌不彻底，因此要正确选择消毒浓度和消毒时间，才能保证较高的外植体存活。
2.6对褐化严重的品种，外植体接种后经过全暗培养10—15天后逐渐增加到1500—2000Lx光照培养，温度从低温到高温，温度16—24℃为宜，不能长期低温培养。
二、组培苗玻璃化问题
在桉树组培时经常会发现组培苗叶、嫩梢呈水晶透明或水浸状，整株矮小或高出，失绿、脆弱易碎，叶表缺少角质层蜡质，没有功能气孔，仅有海绵组织是一种生理失调或病变，在组织培养中危害相当严重，也是亟待解决的问题。
1.发生原因
1.1琼脂硬度和蔗糖浓度与玻璃化成负相关。
1.2 6BA浓度和培养室温度与玻璃化成正相关。
1.3玻璃化是培养瓶内气体与外界交换不畅有关，密闭的封瓶口材料是导致玻璃化的原因之一。
1.4培养基中高的含N量，特别是高的氨态N，也是导致玻璃化的因素之一。
2.解决方法：
2.1利用固体培养基，增加琼脂或卡拉胶浓度,降低培养基的衬质势，促使细胞吸水阻遏，适当提高蔗糖含量或加入渗透剂，降低培养基中的渗透势，降低培养容器内部环境的相对湿度。
2.2适当调低6—BA和GA3的浓底，适量加入IAA和活性碳。
2.3控制温度低温处理，温度不超过32℃,在昼夜变温交替的情况下比恒温效果好，温度过高、生长过快，玻璃苗增多。
2.4增加自然光照，光强控制在1500—3000LX，每天光照12—14小时，试验发现玻璃苗放置于自然光下几天后，茎、叶变红，玻璃化逐渐消失，自然光中紫外线能促进组培苗成熟，加快木质化。
2.5增加Ca 、 Mg 、 M n 、 K 、P 、 Fe元素含量，降低N和CL元素比例，特别降低氨态氮浓度，适当提高硝态氮含量。
2.6改善培养器的通风换气条件，如用棉塞或塑料胶盖子。
2.7用40℃热击处理愈伤组织培养物会降低内源细胞分裂素水平，可消除再生苗的玻璃化。
三、污染问题
桉树组培苗工厂化生产在我国南方发展较快，快繁技术日趋成熟，但组培苗污染率较高，造成经济损失较大，因此如何克服污染问题是不可忽视的技术环节。
1.主要原因
污染一般分为真菌污染和细菌污染，其来源可分为三大类；材料带菌污染、操作不当污染、培养过程感染；细菌污染分外生细菌污染和内生细菌污染，外生细菌污染多数是培养基消毒不合格、接种工具、接种人员操作不当而引起，而内生细菌污染多数是接种材料本身带菌。真菌污染主要来自环境条件。
2.解决方法
2.1改善环境条件，接种室与培养室、缓冲间要定期用高锰酸钾和甲醛薰蒸消毒，每次接种前接种室及工作台要开紫外灯30分钟以上，工作台启动吹风15分钟后才使用，定期（一个月）开紫外灯消毒培养室1-小时，培养室相对湿度控制在70%左右。
2.2定期培训接种人员，严格遵守操作规程，对接种所需工具要严格灭菌后才能使用，工作台内不要堆放过多待用材料，专人负责检验材料是否带菌，淘汰被污染的材料。
2.3经常检查消毒锅的灭菌质量，消毒出锅的培养基用白纱布盖实，让其缓慢冷却，避免外界冷空气倒吸入已灭菌的培养瓶内引起真菌污染。
2.4采用反复茎尖培养的方法脱除桉树组培材料的内生细菌。
2.5对外植体的消毒要正确选用表面消毒剂、消毒浓度和消毒时间。桉树外植体带芽茎段带菌少且易灭菌，繁殖快，大量试验表明：0.1%升汞灭菌7-9分钟是最理想的消毒浓度和消毒时间。根据不同的接种材料，选择消毒剂、消毒浓度和消毒时间也有所不同，需经多次实践摸索，才能找出最佳操作方案。
2.6在培养基中适量加入过滤灭菌后的抗生素如：青霉素GK、链霉素、庆大霉素等有效抑制内生菌的生长。
参考文献：
[1]欧阳磊，桉树组培快繁存在的问题与对策（J）福建林业科技2006、203-206.
[2]曹孜义、刘国民，实用植物组织培养技术教程（M）兰州，甘肃科学技术出版社1996.1-8.
[3]张远华等尾赤桉组培繁殖技术研究（J）广西科技第2008第1期.