毛霉型豆豉中总DNA提取的比较研究

来源 :安徽农业科学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:drgsdrgs
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
  摘要[目的]对毛霉型豆豉中总DNA的提取方法进行比较。[方法]选用常用的3种DNA提取方法(溶菌酶法、蛋白酶KCTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法和改良溶菌酶法)提取发酵豆豉中的总DNA,并测定总DNA的纯度,比较3种方法的优劣。[结果]通过琼脂糖凝胶电泳对提取效果进行观察比较发现,蛋白酶KCTAB法提取豆豉中微生物的宏基因组DNA的纯度最好,质量最高。[结论]蛋白酶KCTAB法更适合豆豉这类发酵食品宏基因组DNA粗提取,可以作为豆豉宏基因组学研究的基础。
  关键词DNA提取;豆豉;微生物;PCR
  中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611(2014)12-03499-03
  基金项目国家自然科学基金青年科学基金项目(31201411);西南大学博士基金项目(SWU112057)。
  作者简介钟燕(1994- ),女,湖南郴州人,本科,专业:食品质量与安全。*通讯作者,副教授,博士,从事食品科学研究。
  豆豉是我国汉族传统发酵豆制品,因其醇香浓郁,富于酯香,成品油润化渣,深受人们喜爱。在我国,豆豉除了供食用外,还有治疗疾病的效果,历代医书都有豆豉治疗疾病的记载,李时珍的《本草纲目》中则有“豆豉具开胃增食、消食化滞、发汗解表、除烦喘等疗效”的记载[1]。现代科学表明,豆豉还有很高的营养价值,含有丰富的蛋白质、糖,以及VB1,VB2和VE等[2],同时含有多种功能成分,具有抗癌、溶解血栓、降血压、抗氧化和抗菌等生理功能[3]。
  但是,毛霉型豆豉的生产采用传统自然发酵工艺,产品很难形成稳定的质量[4]。另外,传统发酵豆豉中的微生物区系复杂,大部分发酵豆豉中微生物起作用的机理仍需揭示[5]。对于豆豉微生物区系的研究是阐明豆豉成熟机制的重要组成部分,而现在主要采用非培养技术的方式进行研究[6-7],豆豉DNA的高质量提取是这项技术研究的前提基础。
  永川毛霉型豆豉是我国传统食品,因其健康美味、营养丰富深受广大消费者喜爱。但豆豉形成过程中的微生物作用机理研究较少,豆豉形成品质不稳定。传统发酵豆豉的微生物区系复杂,大多选择非培养技术进行研究,而提取高质量的DNA是非培养技术的前提条件。笔者通过对豆豉发酵的3种DNA提取方法的比较研究,寻求一种适合发酵食品稳定可靠的DNA提取方法,以期为豆豉微生物后续研究提供参考和依据。
  1材料与方法
  1.1材料
  1.1.1研究对象。处于不同发酵阶段的永川毛霉型豆豉,为永川豆豉食品有限公司经天然制曲发酵,原料大豆产地为吉林省。
  1.1.2主要仪器。MiniPROTEAN Tetro Cell核酸电泳系统,购自BioRAD公司;G:Box EF凝胶成像系统,购自Syngene公司;XW20A多功能食品加工机,购自鑫威电器有限公司;AIR TECH超净工作台,购自苏净安泰公司;LDZX40BI立式自动电热压力蒸汽灭菌器,购自上海申安医疗器械厂;LX100手掌型离心机,购自江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司;GL88B渦旋混合器,购自江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司;UV755B可见紫外分光光度计,购自上海分析仪器总厂;ZHWY211B恒温培养振荡器,购自上海智诚分析仪器有限公司;EDC810双槽PCR仪,购自东胜创新生物科技有限公司。
  1.1.3主要试剂。氯仿、异戊醇、异丙醇、无水乙醇、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钠、DNA染色剂等均为分析纯,均购自北京索莱宝科技有限公司;溶菌酶、蛋白酶K、Marker、SDS、PEG、CTAB和TrisHcl,均购自北京索莱宝科技有限公司。
  1.2方法
  1.2.1永川豆豉生产工艺流程。大豆筛选→浸泡→沥干→常压蒸料→冷却→自然发酵制曲→翻曲→拌和(食盐含量15%、醪糟、白酒)→入罐发酵后熟→成品。
  1.2.2溶菌酶法粗提取DNA[8-9]。参照熊开容从活性污泥中提取DNA的方法,改进后使用[10]。取豆豉样品5.000 g,在无菌条件下转移到15 ml的PBS(pH约7.0)中,搅拌后用4层纱布过滤,于30 ℃、120 r/min稀释振荡15 min,得到的溶液以2 000~3 000 r/min离心5 min,收集到的上清液再以14 000 r/min,4 ℃离心10 min;弃去上清液,用等体积的TES溶液洗涤1次,以14 000 r/min,4 ℃离心10 min,弃去上清液。
  沉淀加入1.5 ml溶菌酶溶液,混合物在37 ℃下 225 r/min振荡1 h;加入0.5 ml裂解缓冲液,0.5 ml磷酸盐缓冲液,0.5 ml氯仿-异戊醇(24∶1,V/V)。离心管在漩涡混合器上3 000 r/min振荡10 min,得到的裂解液以6 000 r/min离心3 min,上清液转入另一离心管。向原管加入0.5 ml去离子水重新离心10 s,2 次离心的上清混合,9 000 r/min离心5 min,收集水相。水相加入0.6倍体积异丙醇沉淀1 h,12 000 r/min离心10 min;得到的沉淀以70%冰预冷的乙醇重复洗涤后风干,溶于500 ml TE缓冲液。取100 μl作DNA浓度测定或其他分析,其余的贮存于-20 ℃。
  1.2.3蛋白酶KCTAB法粗提取DNA。取豆豉样品5.000 g,在无菌条件下转移到15 ml的PBS(ph 7.0)中,搅拌后用4层纱布过滤,30 ℃、120 r/min稀释振荡15 min。得到的溶液以2 000~3 000 r/min离心5 min,收集到的上清液再以14 000 r/min,4 ℃离心10 min,弃去上清液,用等体积的TES溶液洗涤1次,以14 000 r/min,4 ℃离心10 min,弃去上清液。
  主要参照Zhou[11]的方法进行试验,沉淀加入1.0 ml DNA提取液混合,然后加入20 μl 10 mmol/L的Protein K,37 ℃水浴并振荡30 min,再加入150 μl SDS(20%),65 ℃水浴2 h,每20 min倒置1次;11 000 r/min 4 ℃离心分离5 min;将上清液转移到新的5 ml离心管,沉淀再加入0.5 ml提取液和50 μl 10%SDS;涡旋振荡后于65 ℃水浴10 min,11 000 r/min 4 ℃离心5 min,收集上清液合并于上次上清液。重复上述操作,3 次上清合并。上清液中加入等体积的氯仿-异戊醇(24∶1,V/V),颠倒混合;室温6 000 r/min离心5 min,吸取上清液转移至新的5 ml离心管中;水相加入0.6倍体积异丙醇沉淀1 h,于12 000 r/min离心10 min;沉淀以70%冰预冷的乙醇重复洗涤后风干,溶于500 μl TE缓冲液。取100 μl作DNA浓度测定或其他分析,其余的贮存-20 ℃。   1.2.4改良溶菌酶法粗提取DNA。主要依据张瑞福[12]、王建玲[13]从土壤微生物中提取DNA的方法,改进后使用。取5.000 g豆豉样品,在无菌条件下转移到15 ml的磷酸盐缓冲液中,振荡2~3 min后,于5 000 r/min离心5 min,弃去上清液,重复洗涤样品直至上清液基本清澈;再用15 ml磷酸盐缓冲液洗涤,小心转移洗涤液至另一离心管中;5 000 r/min再次离心5 min,弃去上清液。
  取经预处理的豆豉样品,加入0.8 ml的溶菌酶溶液,5 μl蛋白酶K,混合物在37 ℃下200 r/min振荡1 h,然后加入经65 ℃预热过的0.3 ml裂解缓冲液、0.3 ml磷酸盐缓冲液和0.6 ml氯仿/异戊醇(24∶1,V/V),65 ℃水浴10 min,每隔2~3 min置漩涡振荡仪上振荡30 s,然后于5 000 r/min离心3 min,小心吸取上清转入另一2 ml离心管,加入0.6倍体积异丙醇冰浴沉淀30 min,于15 000 r/min离心10 min,弃去液相;沉淀以1.0 ml 75%冷乙醇轻微振荡洗涤,4 ℃下以13 000 r/min离心2 min,待乙醇彻底挥发后,加入500 μl TE缓冲液溶解DNA;取100 μl作DNA浓度测定或其他分析,其余的贮存-20 ℃。
  1.2.5DNA的纯度测定。采用紫外分光光度计直接检测粗提取DNA的分光度,DNA的A260/A280值可以作为评价DNA纯度的一个指标。
  1.2.6DNA的质量测定。用50×TAE溶液配制0.7%琼脂糖凝胶,使用Gold View核酸染料。吸取10 μl DNA溶液,加入1 μl的10×loading Buffer,混合均匀后依次加入点样孔中,然后吸取5 μl的λDNA/HindⅢ Marker加入一端的点样孔,在120 V恒定电压下进行电泳,电泳时间为50 min。电泳结束后在凝胶成像系统中观察电泳结果并拍照、分析。
  2结果与分析
  2.1图像分析图1表明,3种不同细胞裂解方法所提取的DNA在Marker条带的附近出线4条条带,而且提取的DNA条带完整性并不相同。根据图像来看,3号和4号条带的亮度强于溶菌酶和改良溶菌酶法的1号、2号、5号和6号的条带,其中3号模板的条带的亮度为最强,说明该法所提取的DNA得率为最高。
  注:M为λDNA/HindⅢ Marker;1~2为溶菌酶法;3~4为蛋白酶KCTAB法;5~6为改良溶菌酶法。
  2.2不同方法提取的DNA浓度比较A260/A280值在1.8~1.9的范围内说明DNA纯度很高,A260/A280小于1.8说明提取的DNA中含有一些蛋白质和多酚,A260/A280大于1.9说明提取的DNA中含有一些RNA;较纯净的核酸的A260/A230值大于2.0。另外,发酵豆豉中腐殖酸会影响A260吸光度,从而影响DNA纯度[14]。
  由表1可知,3号和4号的A260/A280值接近1.9,A260/A230值接近2.0,说明3、4号样品的DNA纯度比较高,但有RNA污染;1号、2号的A260/A280值和A260/A230值都较低,说明1号和2号样品的DNA纯度没有3号和4号的高,有蛋白质或多酚等的污染;5号和6号的A260/A280值和A260/A230值比1号和2号的更低,说明5号和6号对应的样品DNA纯度很低。
  2.33种提取方法的比较由表2可知,在DNA的提取得率上,蛋白酶KCTAB法优于溶菌酶法和改良后的溶菌酶法。提取后的DNA样品分装冻存在-20 ℃条件下1周后仍可以使用,基本无降解[15]。潘立等以曲霉菌为例,在蛋白酶KCTAB法的基础上建立了一种快速提取丝状真菌DNA的试验方法[18]。吴则东等通过对不同方法提取甜菜干种子的DNA进行比较研究,发现CTAB法比碱裂解法能提取出更高质量的DNA[16]。琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计显示,在试验使用的3种方法中,蛋白酶KCTAB法是提取豆豉中总DNA的最理想的方法。
  3结论
  综上所述,蛋白酶KCTAB法操作比较简单,琼脂糖凝胶电泳显示DNA得率和DNA质量都较高。比较溶菌酶法和改良溶菌酶法,蛋白酶KCTAB法更适合豆豉这类发酵食品宏基因组DNA粗提取,可以作为豆豉宏基因组学研究的基础。
  参考文献
  [1] 张佳琪,吕远平,谭敏.三种大豆发酵制品——豆豉纳豆及天贝的比较[J].食品工业科技,2012,33(9):441-445.
  [2] 穆慧玲,李里特.豆豉的保健功能及开发价值[J].农产品加工·学刊,2008(11):31-32.
  [3] 蒋立文.发酵豆豉的研究进展[J].食品安全质量检测学报,2013(6):1803-1809.
  [4] 柯水国,朱广文.豆类发酵食品的研究进展[J].中小企业管理与科技(下旬刊),2013(5):309-310.
  [5] 杨福明,赵阳,侯静,等.传统大豆发酵食品及其工业化开发关键技术[J].中国调味品,2013(8):18-21.
  [6] 聶志强,韩玥,郑宇,等.宏基因组学技术分析传统食醋发酵过程微生物多样性[J].食品科学,2013(15):198-203.
  [7] 张彩凤,王婷婷,高小宽,等.宏基因组学技术及其应用概述[J].生物学教学,2013(3):7-8.
  [8] GAO P P,ZHAO L P.DNA extract ionfrom activated sludge for molecular community analysis[J].Acta Ecologica Sinica,2002,11(22):2015-2019.
  [9] 刘金英,汤斌.浓香型白酒窖泥中总DNA提取方法的研究[J].安徽工程大学学报,2013(3):8-11.
  [10] 熊开容,张智明,张敏.活性污泥DNA提取方法的研究[J].生物技术,2005,15(4):43-45.
  [11] ZHOU J Z,MARY A B,TIEDJE J M.DNA Recovery from Soils of Diversity Composition[J].Appl Environ Microbiol,1996,62(2):316-322.
  [12] 张瑞福,崔中利,曹慧,等.土壤微生物总DNA的提取和纯化[J].微生物学报,2003,43(2):276.
  [13] 王建玲,赵鹏程,邓弘毅,等.鱿鱼肌肉组织细菌基因组DNA提取方法的优化[J].浙江农业科学,2013(6):737-740.
  [14] CLAASSEN SHANTELLE,DU TOIT ELLOISE,KABA MAMADOU,et al.A comparison of the efficiency of five different commercial DNA extraction kits for extraction of DNA from faecal samples[J].Journal of Microbiological Methods,2013,942:26-32.
  [15] DONG B,YI J,DAI L L,et al.Evaluation of Several DNA Extraction Methods for Obtaining Total Community DNA from Anaerobic Digestion Sludge[J].Procedia Environmental Sciences,2013,18:15-18.
  [16] 潘力,崔翠,王斌.一种用于 PCR 扩增的丝状真菌DNA快速提取方法[J].微生物学报,2010,37(3):450-453.
其他文献
本文依据所掌握的物理学史料,在简要回顾固体物理和表面物理发展历史的基础上,着重叙述肖克莱对表面能级的描述、表面态的最早认识和半导体表面特性研究,尤其是对开启了半导
采用固相微萃取(SPME),顶空(HS)进样和GC-MS(气相色谱-质谱)联用技术对枫香脂中的挥发性化学成分进行了对比分析,优选了枫香脂挥发性成分的萃取方法和分析条件(萃取头极性,膜的厚度
国内围绕旅游发展权益分配的不公平和不公正现象已呈常态化。利益相关者之間权力结构失衡和调节保障机制缺位,愈益成为制约旅游目的地可持续发展的关键因素。旅游发展所引发的利益关系调整主要是在资本、政府与地方三者之间,旅游决策和利益分配更多是在资本和权力主导下进行,地方社区往往处于被动、失语和边缘化状态。过往学者更多从公平交易(fare trade)、社区参与、社区赋权等概念角度关注地方在旅游发展中的失权问
摘要 Argonaute2(Ago2)蛋白是RNA诱导沉默复合体(RNAinduced silencing complex、RISC)的核心元件,不仅在miRNA/siRNA通路中促使靶mRNA降解或抑制其蛋白质翻译,调节miRNAs生物合成和成熟,对生物生长发育、干细胞分化和肿瘤形成等有密切关系。  关键词 Argonaute2;RISC;翻译抑制;肿瘤  中图分类号 S188 文献标识码 A
[摘要]乡村旅游开发过程中通常会涉及对农村土地的征用,农户的集体行为将影响征地的成败,但多数研究对农户集体行为的动态过程与作用机制关注不足。门槛模型从个体异质性出发,强调集体行为的互动聚合过程,这为农户集体行为研究提供了一个颇为有益的理论分析视角。以重庆市大河口村石泉苗寨在乡村旅游开发过程中的征地事件为例,分析农户集体行为过程,识别影响农户集体行为的关键变量及其作用机制。研究表明:农户所处的行动位
摘要[目的]分析外源Ca2+对玉米幼苗在盐胁迫下的缓解效果。[方法]以玉米为试验材料,用 100 mmol/L NaCl对玉米进行盐胁迫处理(对照组),试验组在此基础上加入20 mmol/L CaCl2溶液,待玉米幼苗长至三叶期后测定其生理生化指标。[结果]施加了外源Ca2+后玉米幼苗叶片中POD活性在005水平显著升高,可溶性糖和叶绿素含量在005水平显著增加;MDA和脯氨酸含量在005水平显著