【摘 要】
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目的 构建小鼠细胞分裂周期蛋白25b(CDC25b)突变基因的真核表达载体,并观察其在小鼠G2期受精卵细胞中的表达.方法 采用PCR法从野生型CDC25b模版上扩增CDC25b(S15A)和CDC25b(S
【机 构】
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010059内蒙古呼和浩特,内蒙古医科大学附属医院临床检验诊断学教研室
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目的 构建小鼠细胞分裂周期蛋白25b(CDC25b)突变基因的真核表达载体,并观察其在小鼠G2期受精卵细胞中的表达.方法 采用PCR法从野生型CDC25b模版上扩增CDC25b(S15A)和CDC25b(S15D)突变基因,定向插入pcDNA3.1(+)-3flag-C空载体中,由限制性内切酶BamH Ⅰ和Kpn Ⅰ进行双酶切电泳后测序验证,构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-3flag-CDC25b(S15A)和pcDNA3.1 (+)-3flag-CDC25b(S15D).采用脂质体法将其转染至Stbl3感受态细胞,质粒经在感受态细胞内转化、抽提、酶切及测序鉴定正确后,将重组真核表达质粒用显微注射法注射至小鼠G2期受精卵内,采用Western blot法检测重组质粒突变型CDC25b的表达.结果 pcDNA3.1(+)-3flag-CDC25b(S15A)和pcDNA3.1(+)-3flag-CDC25b (S15D)真核表达载体经酶切和测序鉴定,酶切结果显示与目的片段大小一致,测序结果显示突变序列正确;将其注射至小鼠G2期受精卵48 h,可检测到细胞内CDC25b蛋白表达增加(P＜0.05).结论 成功构建CDC25b (S15A)和CDC25b(S15D)真核表达载体,验证了突变型CDC25b蛋白表达,可为CDC25b对小鼠受精卵发育调节的研究提供实验基础.
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