【摘 要】
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类人弹性蛋白是由VAPGVG六肽重复序列构成的多肽.研究通过全基因合成获得上游引入NcoⅠ和下游引入XhoⅠ限制性内切酶位点的[(VAPGVG)3S]4基因编码序列,通过定向递归连接技术
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类人弹性蛋白是由VAPGVG六肽重复序列构成的多肽.研究通过全基因合成获得上游引入NcoⅠ和下游引入XhoⅠ限制性内切酶位点的[(VAPGVG)3S]4基因编码序列,通过定向递归连接技术在pMD19-T simple克隆载体中构建[(VAPGVG)3S]32基因编码序列.利用NcoⅠ和XhoⅠ双酶切从重组克隆载体中回收[(VAPGVG)3s]32 (ELPs)基因编码序列,在T4DNA连接酶作用下与NcoⅠ和XhoⅠ双酶切处理的线性化载体DNA分子pET28a(+)重组,重组混合物转化大肠杆菌Top10感受态细胞.从添加有50 μg·mL-1卡那霉素的LB平板上随机挑取37℃培养过夜的转化克隆,碱法小量抽提质粒DNA,经酶切及序列测定筛选出序列正确的重组质粒DNA转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞.从添加有50 μg· mL-1卡那霉素的LB平板上随机挑取37℃培养过夜的转化克隆至新鲜配制的TB液体培养基中,于37℃、200 r· min-1培养至OD600约为0.60h,添加终浓度为100 μg· mL-1的IPTG诱导类人弹性蛋白表达3h,SDS-PAGE凝胶电泳及Western blotting分析表明,该研究成功构建了类人弹性蛋白原核表达载体,在IPTG诱导作用下以可溶性状态高效表达.灰度扫描分析显示,重组类人弹性蛋白经IPTG诱导表达3h后,可达宿主细胞可溶性蛋白的28.3％.该工作为以大肠杆菌为表达宿主,大量制备类人弹性蛋白用于生物医学材料奠定了良好的基础.
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