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目的:建立HPLC梯度洗脱法同时测定复方硫酸软骨素片中硫酸软骨素、芍药苷和甘草酸3个活性成分的含量。方法:采用InertSustain C18色谱柱（4.6 mm×250 mm, 5μm）,以5 mmol·L-1庚烷磺酸钠溶液为流动相A,乙腈为流动相B,梯度洗脱，柱温为30℃,检测波长为230 nm。结果:硫酸软骨素、芍药苷和甘草酸分别在0.292 3～7.307 6、0.002 6～0.132 0和0.006 1～0.301 8 mg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系；平均加样回收率为98.5%～99.7%,RSD为1.0%～1.2%。4批样品中，硫酸软骨素、芍药苷和甘草酸的含量分别为72.954 7～74.103 6、0.661 3～0.689 8和1.502 3～1.520 9 mg/片。结论:本研究建立HPLC梯度洗脱法同时测定复方硫酸软骨素片中3个活性成分，该方法简便、快速、准确，可用于复方硫酸软骨素片的质量控制。