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【摘 要】 目的：建立松布力糖浆、强心艾维西木糖浆、木米亚片、复方苏润江片、通窍阿亚然及派克片、复方赛比尔片及库克亚片等维吾尔医医院制剂微生物限度检查方法。方法：根据《中国药典》2010年版的规定，用5种阳性对照菌组对回收率试验进行检测样品是否含抑菌成分。结果：松布力糖浆及强心艾维西木糖浆无明显抑菌现象，可以采用平皿法；木米亚片、复方苏润江片、通窍阿亚然及派克片、复方赛比尔片及库克亚片等对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌的回收率均值在65%-88%，有明显的抑菌作用，应该采用培养基稀释法。控制菌验证中，试验菌生长很好。结论：该方法对所选7种样品的检验有效可行，可用于上述品种的微生物限度检查。
【关键词】 微生物限度检查；方法学验证；医院制剂
【中图分类号】R29 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2014）06-0003-02
原料的处理不当或者包装不严密等是导致医院制剂污染的主要原因，为了达到药品生产的安全指标必须对其进行微生物限度检查保证制剂的安全有效。
1 试验材料
1.1 供试品 松布力糖浆（批号：201303084-1、201303084-2、201303084-3）；强心艾维西木糖浆（批号：201303083-1、201303083-2、201303083-3）；木米亚片（批号：201304102-1、201304102-2、201304102-3）；复方苏润江片（批号：201303078-1、201303078-2、201303078-3）；通窍阿亚然及派克片（批号： 201303075-1、201303075-2、201303075-3）；复方赛比尔片（批号：201303073-1、201303073-2、201303073-3）库克亚片（批号：201303057-1、201303057-2、201303057-3），以上制剂均由喀什地区维吾尔医医院提供。
1.2 试验用菌种（第四代） 金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]、大肠埃希菌[CMCC（B）44102]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉菌[CMCC（F）98003]均由中国药品生物制品检定所提供。
1.3 稀释液、缓冲液 0.9%无菌氯化钠溶液、pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号：100708）。
1.4 培养基 营养琼脂培养基（批号：0102262）、胆盐乳糖增菌液（批号：0102282）、营养肉汤培养基（批号：101213）、虎红培养基（批号：010214）、4-甲基伞形酮葡糖苷酸（MUG）培养基（批号：100128）、胆盐硫乳发酵培养基，均由北京三药科技开发有限公司提供。
1.5 其他物品按规定灭菌备用。
2 方法和结果
2.1 菌液的制备 取大肠埃希菌[CMCC（B）44102]、金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]的新鲜培养物，分别接种于营养肉汤培养基，30～35℃培养18～24h；取白色念珠菌的新鲜培养物接种于改良马丁培养基中，23～28℃培养24～48h。上述培养物用0.9%氯化钠溶液（使用前高压霉菌使成无菌）稀释成1ml含50～100cfu菌的菌悬液；黑曲霉的新鲜培养物接种于改良马丁琼脂斜面的培养基中，培养5至7天，使大量孢子产生，用0.9%无菌氯化钠溶液，将其洗脱，然后用0.9%的无菌氯化钠溶液把菌液稀释至1ml中含50～100cfu的菌悬液，保存备用。
2.2 菌液的检验 分别取上述三种菌菌悬液各1ml，注入用营养琼脂培养基20ml的平皿中，平行测定两皿，30℃至35℃培养48小时，计数，菌液应为每ml含50～100cfu。
取上述白色念珠菌、黑曲霉菌菌悬液各1ml，用加入有虎红琼脂培养基20ml的平皿中，为了减少实验中的随机误差平行测定两皿，规定的温度范围内培养72小时，观察，计数，菌液中有效菌株的浓度应该在每1ml含50～100cfu的范围之内。
2.3 供试品溶液的制备[2]分别取已准备好的固体样品各10g，研细，液体样品10ml加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释至100ml，制成10-1的供试液。
3 回收率测定[1]
3.1 细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
3.1.1 平皿法：取供试液1ml及50～100cfu的试验菌，分别加入培养皿中，平行制备2个平皿，将它凝固后，培养48小时，按《中国药典》规定的方法测定其菌落数，结果见表1。
由表1可知，松布力糖浆及强心艾维西木糖浆对上述五种代表菌回收率均高于70%以上，无明显抑菌现象，细菌、霉菌及酵母菌检查可以采用平皿法，其他的制剂对可能含有抑菌成分需要进一步验证。
3.1.2 培养基稀释法 将上述试验菌株接种于0.2ml/皿、0.1ml/皿的供试品液中，再加20ml琼脂培养基，培养48小时，观察结果，细菌计数，测定其回收率，结果见表2、3。
从表2可以看出木米亚片、复方苏润江片、通窍阿亚然及派克片库克亚片等品种对上述代表菌回收率均高于70%以上，无明显抑菌现象。细菌、霉菌及酵母菌检查可以采用培养基稀释法（0.2ml/皿）。
从表3可以看出复方赛比尔片对上述代表菌回收率均高于70%以上，无明显抑菌现象。细菌、霉菌及酵母菌检查可以采用培养基稀释法（0.1ml/皿）。
3.2 控制菌检查方法验证
3.2.1 阴性菌对照组 取金黄色葡萄球菌50～100cfu/ml，接种胆盐乳糖增菌培养基中，置35℃培养18-24h，阴性菌对照组为阴性（未生长）；取金黄色葡萄球菌50～100cfu/ml，接种亚酸盐肉汤增菌培养基中，置35℃培养18～24h，阴性菌对照组为阴性（未生长）；取金黄色葡萄球菌50～100cfu/ml，接种胆盐乳糖发酵培养基中，置35℃培养18～24h，阴性菌对照组为阴性（未生长）。
3.2.2 试验组 取3瓶（100 ml/瓶）胆盐乳糖增菌培养基，分别接入1： 10供试液10ml，取3支胆盐乳糖发酵管，分别接入1：10供试液1ml；取3瓶 （200ml/瓶）亚硝酸盐肉汤增菌培养基，分别接入样品10g；每组其中一瓶（管）作为样品组；另一瓶（管）加入相应的阴性对照菌作为试验组；第三瓶（管）加入相应的阳性对照菌作为阴性菌对照组；置35℃培养24～48h，结果见表4。
4 讨论
从表1中可见第一及第二个制剂中的回收率不低于70%，对细菌的生长基本无抑制作用，可以采用平皿法。木米亚片、复方苏润江片、通窍阿亚然及派克片、复方赛比尔片及库克亚片等对金黄色黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌及大肠埃希菌的回收率均值在65%-88%之间，说明有显著地抑菌作用，所以应采用培养基稀释法。根据实验结果确定下属试验方法。
本试验结果表明：松布力糖浆及强心艾维西木糖浆对5种阳性对照菌的平皿法的回收率达到70%以上，证明无明显的抑菌作用，因此常规方法可以做上述两种制剂的微生物限度检查。抑菌作用比较弱的木米亚片，复方苏润江片，通窍阿亚然及派克片，复方赛比尔片及库克亚片可以采用培养基稀释法（0.2ml/皿）。
参考文献
[1] 马越，特玉香，杜平华，等.16种中成药微生物限度检査法的验证[J].中国药品标准，2005，6（6）：356-359.
[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2010：附录79-88.
【关键词】 微生物限度检查；方法学验证；医院制剂
【中图分类号】R29 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2014）06-0003-02
原料的处理不当或者包装不严密等是导致医院制剂污染的主要原因，为了达到药品生产的安全指标必须对其进行微生物限度检查保证制剂的安全有效。
1 试验材料
1.1 供试品 松布力糖浆（批号：201303084-1、201303084-2、201303084-3）；强心艾维西木糖浆（批号：201303083-1、201303083-2、201303083-3）；木米亚片（批号：201304102-1、201304102-2、201304102-3）；复方苏润江片（批号：201303078-1、201303078-2、201303078-3）；通窍阿亚然及派克片（批号： 201303075-1、201303075-2、201303075-3）；复方赛比尔片（批号：201303073-1、201303073-2、201303073-3）库克亚片（批号：201303057-1、201303057-2、201303057-3），以上制剂均由喀什地区维吾尔医医院提供。
1.2 试验用菌种（第四代） 金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]、大肠埃希菌[CMCC（B）44102]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉菌[CMCC（F）98003]均由中国药品生物制品检定所提供。
1.3 稀释液、缓冲液 0.9%无菌氯化钠溶液、pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号：100708）。
1.4 培养基 营养琼脂培养基（批号：0102262）、胆盐乳糖增菌液（批号：0102282）、营养肉汤培养基（批号：101213）、虎红培养基（批号：010214）、4-甲基伞形酮葡糖苷酸（MUG）培养基（批号：100128）、胆盐硫乳发酵培养基，均由北京三药科技开发有限公司提供。
1.5 其他物品按规定灭菌备用。
2 方法和结果
2.1 菌液的制备 取大肠埃希菌[CMCC（B）44102]、金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]的新鲜培养物，分别接种于营养肉汤培养基，30～35℃培养18～24h；取白色念珠菌的新鲜培养物接种于改良马丁培养基中，23～28℃培养24～48h。上述培养物用0.9%氯化钠溶液（使用前高压霉菌使成无菌）稀释成1ml含50～100cfu菌的菌悬液；黑曲霉的新鲜培养物接种于改良马丁琼脂斜面的培养基中，培养5至7天，使大量孢子产生，用0.9%无菌氯化钠溶液，将其洗脱，然后用0.9%的无菌氯化钠溶液把菌液稀释至1ml中含50～100cfu的菌悬液，保存备用。
2.2 菌液的检验 分别取上述三种菌菌悬液各1ml，注入用营养琼脂培养基20ml的平皿中，平行测定两皿，30℃至35℃培养48小时，计数，菌液应为每ml含50～100cfu。
取上述白色念珠菌、黑曲霉菌菌悬液各1ml，用加入有虎红琼脂培养基20ml的平皿中，为了减少实验中的随机误差平行测定两皿，规定的温度范围内培养72小时，观察，计数，菌液中有效菌株的浓度应该在每1ml含50～100cfu的范围之内。
2.3 供试品溶液的制备[2]分别取已准备好的固体样品各10g，研细，液体样品10ml加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释至100ml，制成10-1的供试液。
3 回收率测定[1]
3.1 细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
3.1.1 平皿法：取供试液1ml及50～100cfu的试验菌，分别加入培养皿中，平行制备2个平皿，将它凝固后，培养48小时，按《中国药典》规定的方法测定其菌落数，结果见表1。
由表1可知，松布力糖浆及强心艾维西木糖浆对上述五种代表菌回收率均高于70%以上，无明显抑菌现象，细菌、霉菌及酵母菌检查可以采用平皿法，其他的制剂对可能含有抑菌成分需要进一步验证。
3.1.2 培养基稀释法 将上述试验菌株接种于0.2ml/皿、0.1ml/皿的供试品液中，再加20ml琼脂培养基，培养48小时，观察结果，细菌计数，测定其回收率，结果见表2、3。
从表2可以看出木米亚片、复方苏润江片、通窍阿亚然及派克片库克亚片等品种对上述代表菌回收率均高于70%以上，无明显抑菌现象。细菌、霉菌及酵母菌检查可以采用培养基稀释法（0.2ml/皿）。
从表3可以看出复方赛比尔片对上述代表菌回收率均高于70%以上，无明显抑菌现象。细菌、霉菌及酵母菌检查可以采用培养基稀释法（0.1ml/皿）。
3.2 控制菌检查方法验证
3.2.1 阴性菌对照组 取金黄色葡萄球菌50～100cfu/ml，接种胆盐乳糖增菌培养基中，置35℃培养18-24h，阴性菌对照组为阴性（未生长）；取金黄色葡萄球菌50～100cfu/ml，接种亚酸盐肉汤增菌培养基中，置35℃培养18～24h，阴性菌对照组为阴性（未生长）；取金黄色葡萄球菌50～100cfu/ml，接种胆盐乳糖发酵培养基中，置35℃培养18～24h，阴性菌对照组为阴性（未生长）。
3.2.2 试验组 取3瓶（100 ml/瓶）胆盐乳糖增菌培养基，分别接入1： 10供试液10ml，取3支胆盐乳糖发酵管，分别接入1：10供试液1ml；取3瓶 （200ml/瓶）亚硝酸盐肉汤增菌培养基，分别接入样品10g；每组其中一瓶（管）作为样品组；另一瓶（管）加入相应的阴性对照菌作为试验组；第三瓶（管）加入相应的阳性对照菌作为阴性菌对照组；置35℃培养24～48h，结果见表4。
4 讨论
从表1中可见第一及第二个制剂中的回收率不低于70%，对细菌的生长基本无抑制作用，可以采用平皿法。木米亚片、复方苏润江片、通窍阿亚然及派克片、复方赛比尔片及库克亚片等对金黄色黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌及大肠埃希菌的回收率均值在65%-88%之间，说明有显著地抑菌作用，所以应采用培养基稀释法。根据实验结果确定下属试验方法。
本试验结果表明：松布力糖浆及强心艾维西木糖浆对5种阳性对照菌的平皿法的回收率达到70%以上，证明无明显的抑菌作用，因此常规方法可以做上述两种制剂的微生物限度检查。抑菌作用比较弱的木米亚片，复方苏润江片，通窍阿亚然及派克片，复方赛比尔片及库克亚片可以采用培养基稀释法（0.2ml/皿）。
参考文献
[1] 马越，特玉香，杜平华，等.16种中成药微生物限度检査法的验证[J].中国药品标准，2005，6（6）：356-359.
[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2010：附录79-88.