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摘要 以二倍体野生草莓与八倍体栽培种草莓进行杂交，本研究以绿色草莓、宁玉2个品种为杂交试材，研究子代花粉生活力对后代育性的影响。结果表明：宁玉及绿色草莓花粉生活力最高，花粉萌发率达到92%，其子代花粉活力偏低，花粉萌发率在20%以下；宁玉每枚花药中花粉数量为1.98万粒，绿色草莓每枚花药中花粉数量为1.07万粒，其杂交子代每枚花药花粉数量平均为1 741粒，明显偏低。由此可见，二倍体与八倍体杂交后代花粉生活力均偏低，会影响其后代果实结实率，后期工作将通过染色体加倍手段获得高倍体可育后代。
关键词 绿色草莓；后代；花粉生活力；萌发率
中图分类号 S668.4 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）11-0084-02
Abstract The interspecific hybrid was obtained from the cross of a diploid species and Fragaria ananassa Duch. Fragaria viridis Duch. and cultivar strawberry Ningyu was used as materials，and the effects of pollen viability on the fertility of the progeny were studied in this study. The results showed that the pollen viability of Fragaria viridis Duch. and cultivar strawberry Ningyu was the highest，the pollen germination rate reached 92%.The pollen viability of F1 generation was lower，the pollen germination rate was below 20%；The pollen quantity of per anther in the Ningyu were 1.98×104，and the pollen quantity of per anther in the Fragaria viridis Duch. were 1.07×104，and the pollen number of its hybrid progeny were averaged at 1 741 grains.It can be seen that the pollen viability of diploid and eight diploid hybrid progeny was low，which will affect the fruit setting rate.The high ploidy was obtained by chromosom doubling method in the later work.
Key words Fragaria viridis Duch.；Later generation；pollen viability；germination rate
花粉是高等植物的雄配子体，在有性繁殖中传递着雄性亲本的遗传信息。花粉既是植物遗传、育种、进化、生殖等研究的重要对象，又是孢粉分析、蜂群培育、药物制造、医疗及生理试验等的重要材料[1]。花粉萌发和花粉管生长是植物完成有性生殖的重要环节，花粉管具有顶端极性生长的特征，其生长过程涉及一系列的反应，其中包括细胞—细胞之间的识别与信号传导、细胞内的信号传导以及其他一些目前尚不明确的因素。花粉能否正常萌发和花粉管能否正常生长则是由草莓品种特性而定。花粉活力是花粉质量的重要生理指标，花粉生活力直接影响草莓的结果特性、果实品质及杂交育种时的成功率，花粉在柱头上的萌发率对受精具有十分重要的作用，其活力的测定是草莓品种鉴定及亲缘关系分类的重要研究内容[2-4]。宁玉是早熟、抗病草莓新品种，果实甜、香味浓、耐贮运[5]。绿色草莓（Fragaria viridis Duch.，2n=2x=14）为蔷薇科（Rosaceae）草莓属（Fragaria）二倍体野生资源，具有抗病性强特性[6]。本研究利用二倍体野生种与栽培种杂交，采用花粉管萌发法和花粉染色法[7-8]来测定宁玉、绿色草莓及其子代株系的花粉生活力，从而分析出二倍体与八倍体杂交后代花粉发育特性，为草莓育种工作者在人工辅助授粉、杂交授粉、栽培管理、分子机理等方面的研究提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试材采集与处理
试验材料来自江苏省农业科学院园艺研究所草莓试验园，于2015年10月28日至11月11日10：00左右采集花蕾為中蕾的草莓花朵各5～10朵，品系包括绿色草莓、栽培草莓宁玉各1个及其20个杂交株系，将花药用镊子剥入5 mL小药瓶中，打开瓶盖放在干燥器中于25 ℃左右散粉，待花药自然开裂散出花粉粒后进行试验（若暂时不试验，可把称量瓶盖上，置于4 ℃冰箱中贮藏备用）。
1.2 花粉萌发率的测定
1.2.1 采用亚历山大花粉染色法[7]来测定父母本与子代的花粉萌发率。将花药散粉较多的品系拨出一部分花药至1.5 mL离心管中，吸取固定剂500 μL加入到其中，固定至少2 h，然后吸取100 μL花粉固定液于载玻片（平）上，自然干2～3 min，再加1滴染色液于花粉上，加上盖玻片，晾30 min或在酒精灯上过一下，然后在显微镜视野中观察花粉染色情况，若染成红色说明是正常萌发花粉，蓝色为败育花粉。
花粉萌发率（%）=（正常花粉数/花粉总数）×100
1.2.2 花粉管萌发试验法。花粉管萌发试验所采用的培养基由浓度为15%蔗糖、4%琼脂和0.1%硼酸配置而成。培养基配置完成后，吸取100 μL具有凹面的载玻片上，待凝固后，用头发丝蘸取少许花粉均匀地散播在置有培养基的载玻片上，然后将载玻片放入铺有吸水纸的培养皿中保湿，置于25.0 ℃左右的恒温培养箱中或空调房中培养，至少培养2 h后，在显微镜下镜检其发芽率，当花粉管长度大于花粉粒的直径时，被认为萌发。 1.3 花粉数量的测定
取每一株系1朵完整花药，计算数量，在20～25枚，放入1.5 mL离心管中在25 ℃下散粉，待花粉完全散出后，加入1 mL蒸馏水，上下颠倒振荡，使花粉粒均匀分布；取0.1 mL花粉水溶液稀释至1 mL，吸取10 μL滴于载玻片上，在显微镜下统计花粉粒总数及畸形花粉粒数，重复3次。
每枚花药中的花粉数量（粒）=（1 000×N）/n
其中N代表视野中花粉个数，n代表每朵花花药数量。
2 结果与分析
2.1 不同株系的花粉萌发率
从表1可以看出，绿色草莓及宁玉2个草莓品种的花粉萌發率极高，其子代花粉萌发率为“0”的有10个株系，1%～20%有8个株系，说明子代绝大多数花粉为育性差；而大于20%有2个株系，可能与父母本花粉减数分裂时，存在未减数配子，杂交后代得到偶数倍性，从而获得可育花粉，这种推测还需进行染色体倍性观察证实。用显微镜观察时，可以看到宁玉在载玻片上正常花粉为饱满的近球形，且在视野中看明显大而圆，花粉萌发培养结果均看到萌发的花丝，见图1和图2；后代在视野中观察很小且皱缩，而且视野中只零星散布着正常花粉，见图3。
2.2 花粉数量及败育花粉的测定
通过显微镜下多视野观察，计算得出栽培种宁玉与野生草莓品种绿色草莓及它们子代每枚花药中的花粉数量分别为19 800、10 700、1 741粒，父母本与后代花粉粒差异显著。统计数据显示，2个父母本的败育花粉数不多，本研究中宁玉败育花粉数量不足10%，绿色草莓败育花粉约1 000粒，败育花粉率为10%，其子代败育花粉率大多数达到80%以上，这将决定后代结实率会极低。
3 结论与讨论
目前，研究比较多的花粉染色法为氯化三苯基四氮唑（TTC）染色测定法和碘—碘化钾染色测定法[9]，其效果不是十分明显，而且在视觉上很难辨别某些花粉是否被染色，本研究采用亚历山大染色方法，不管败育或具有生活活力的花粉均可以被染色，而且颜色对比明显，容易区分并判断活力。通过染色法研究结果表明，宁玉具有较强的花粉生活力，花粉数量多，败育花粉数少，这与实际生产中宁玉果实畸形果率低、产量高这一现象相吻合。研究报道，将八倍体栽培种草莓与二倍体草莓进行远源杂交，其父母本若正常减数分裂会得到5倍体不结实子代，育性较差[10]，而本文花粉活力检测结果显示后代败育花粉较多，与这一结论相符合。这也充分说明花粉生活力直接影响草莓的结果特性及杂交育种的成功率。本研究后期工作将通过染色体加倍试验改变后代染色体倍性，从而实现杂交后代可育性。这些新倍性材料的获得为培育10x、12x等高倍体草莓新品种、新类型带来希望，对改良现代栽培草莓的品质、抗性等有较大意义[11-15]。
4 参考文献
[1] 左丹丹，明军，刘春，等.植物花粉生活力检测技术进展[J].安徽农业科学，2007，35（16）：4742-4745.
[2] 赵密珍，王桂霞，钱亚明.草莓种质资源描述规范和数据标准[M].北京：中国农业出版社，2006：1.
[3] 王壮伟，赵密珍，钱亚明，等.草莓花粉生活力的测定[J].东北农业大学学报，2010，41（3）：48-52.
[4] MORI Y，TAKATSUJI M，YASUOKA T.Effect of pulsed white LED light on the growth of lettuce[J].Journal of society of High Technology in Agriculture，2002，14（3）：136-140.
[5] 赵密珍，王壮伟，钱亚明，等.草莓新品种宁玉[J].园艺学报，2011，38（7）：1411-1412.
[6] 葛春峰，张海元，陈丙义，等.绿色草莓（Fragaria viridis Duch.）自交后代的性状观察及评价[J].植物遗传资源学报，2014，15（3）：630-638.
[7] ROSS PETERSON，JANET P SLOVIN，CHANGBIN CHEN.A simplified method for differential staining of aborted and non-aborted pollen grains[J].International Journal of Plant Biology，2010，1（13）：66-69.
[8] 庞夫花，赵密珍，王钰，等.草莓新品种宁玉的花粉特性研究[J].中国果树，2014（5）：27-29.
[9] 高秀岩，刘帅，满丽婷，等.草莓花粉生活力对杂交座果率的影响[J].安徽农业科学，2008，36（31）：13613-13614.
[10] 雷家军，谭昌华，代汉萍，等.草莓五倍体种间杂种的获得及回交研究[J].吉林农业大学学报，2010，32（3）：284-288.
[11] 明晓，吴璇，汉由之，等.黄毛草莓花粉活力及柱头可授性测定[J].黑龙江农业科学，2012（5）：80-82.
[12] 雷家军，范雯，王善光，等.五倍体野生草莓花粉性状及减数分裂的观察[J].沈阳农业大学学报，2009，40（4）：396-399.
[13] 时翠平.草莓属植物细胞学研究[D].保定：河北农业大学，2001.
[14] 韩柏明，赵密珍，王静，等.草莓属及其近缘属植物的花粉形态电镜观察[J].东北农业大学学报，2013（10）：104-110.
[15] 雷家军，代汉萍，邓明琴，等.草莓种间杂交的研究[J].园艺学报，2002，29（6）：519-523.
关键词 绿色草莓；后代；花粉生活力；萌发率
中图分类号 S668.4 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）11-0084-02
Abstract The interspecific hybrid was obtained from the cross of a diploid species and Fragaria ananassa Duch. Fragaria viridis Duch. and cultivar strawberry Ningyu was used as materials，and the effects of pollen viability on the fertility of the progeny were studied in this study. The results showed that the pollen viability of Fragaria viridis Duch. and cultivar strawberry Ningyu was the highest，the pollen germination rate reached 92%.The pollen viability of F1 generation was lower，the pollen germination rate was below 20%；The pollen quantity of per anther in the Ningyu were 1.98×104，and the pollen quantity of per anther in the Fragaria viridis Duch. were 1.07×104，and the pollen number of its hybrid progeny were averaged at 1 741 grains.It can be seen that the pollen viability of diploid and eight diploid hybrid progeny was low，which will affect the fruit setting rate.The high ploidy was obtained by chromosom doubling method in the later work.
Key words Fragaria viridis Duch.；Later generation；pollen viability；germination rate
花粉是高等植物的雄配子体，在有性繁殖中传递着雄性亲本的遗传信息。花粉既是植物遗传、育种、进化、生殖等研究的重要对象，又是孢粉分析、蜂群培育、药物制造、医疗及生理试验等的重要材料[1]。花粉萌发和花粉管生长是植物完成有性生殖的重要环节，花粉管具有顶端极性生长的特征，其生长过程涉及一系列的反应，其中包括细胞—细胞之间的识别与信号传导、细胞内的信号传导以及其他一些目前尚不明确的因素。花粉能否正常萌发和花粉管能否正常生长则是由草莓品种特性而定。花粉活力是花粉质量的重要生理指标，花粉生活力直接影响草莓的结果特性、果实品质及杂交育种时的成功率，花粉在柱头上的萌发率对受精具有十分重要的作用，其活力的测定是草莓品种鉴定及亲缘关系分类的重要研究内容[2-4]。宁玉是早熟、抗病草莓新品种，果实甜、香味浓、耐贮运[5]。绿色草莓（Fragaria viridis Duch.，2n=2x=14）为蔷薇科（Rosaceae）草莓属（Fragaria）二倍体野生资源，具有抗病性强特性[6]。本研究利用二倍体野生种与栽培种杂交，采用花粉管萌发法和花粉染色法[7-8]来测定宁玉、绿色草莓及其子代株系的花粉生活力，从而分析出二倍体与八倍体杂交后代花粉发育特性，为草莓育种工作者在人工辅助授粉、杂交授粉、栽培管理、分子机理等方面的研究提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试材采集与处理
试验材料来自江苏省农业科学院园艺研究所草莓试验园，于2015年10月28日至11月11日10：00左右采集花蕾為中蕾的草莓花朵各5～10朵，品系包括绿色草莓、栽培草莓宁玉各1个及其20个杂交株系，将花药用镊子剥入5 mL小药瓶中，打开瓶盖放在干燥器中于25 ℃左右散粉，待花药自然开裂散出花粉粒后进行试验（若暂时不试验，可把称量瓶盖上，置于4 ℃冰箱中贮藏备用）。
1.2 花粉萌发率的测定
1.2.1 采用亚历山大花粉染色法[7]来测定父母本与子代的花粉萌发率。将花药散粉较多的品系拨出一部分花药至1.5 mL离心管中，吸取固定剂500 μL加入到其中，固定至少2 h，然后吸取100 μL花粉固定液于载玻片（平）上，自然干2～3 min，再加1滴染色液于花粉上，加上盖玻片，晾30 min或在酒精灯上过一下，然后在显微镜视野中观察花粉染色情况，若染成红色说明是正常萌发花粉，蓝色为败育花粉。
花粉萌发率（%）=（正常花粉数/花粉总数）×100
1.2.2 花粉管萌发试验法。花粉管萌发试验所采用的培养基由浓度为15%蔗糖、4%琼脂和0.1%硼酸配置而成。培养基配置完成后，吸取100 μL具有凹面的载玻片上，待凝固后，用头发丝蘸取少许花粉均匀地散播在置有培养基的载玻片上，然后将载玻片放入铺有吸水纸的培养皿中保湿，置于25.0 ℃左右的恒温培养箱中或空调房中培养，至少培养2 h后，在显微镜下镜检其发芽率，当花粉管长度大于花粉粒的直径时，被认为萌发。 1.3 花粉数量的测定
取每一株系1朵完整花药，计算数量，在20～25枚，放入1.5 mL离心管中在25 ℃下散粉，待花粉完全散出后，加入1 mL蒸馏水，上下颠倒振荡，使花粉粒均匀分布；取0.1 mL花粉水溶液稀释至1 mL，吸取10 μL滴于载玻片上，在显微镜下统计花粉粒总数及畸形花粉粒数，重复3次。
每枚花药中的花粉数量（粒）=（1 000×N）/n
其中N代表视野中花粉个数，n代表每朵花花药数量。
2 结果与分析
2.1 不同株系的花粉萌发率
从表1可以看出，绿色草莓及宁玉2个草莓品种的花粉萌發率极高，其子代花粉萌发率为“0”的有10个株系，1%～20%有8个株系，说明子代绝大多数花粉为育性差；而大于20%有2个株系，可能与父母本花粉减数分裂时，存在未减数配子，杂交后代得到偶数倍性，从而获得可育花粉，这种推测还需进行染色体倍性观察证实。用显微镜观察时，可以看到宁玉在载玻片上正常花粉为饱满的近球形，且在视野中看明显大而圆，花粉萌发培养结果均看到萌发的花丝，见图1和图2；后代在视野中观察很小且皱缩，而且视野中只零星散布着正常花粉，见图3。
2.2 花粉数量及败育花粉的测定
通过显微镜下多视野观察，计算得出栽培种宁玉与野生草莓品种绿色草莓及它们子代每枚花药中的花粉数量分别为19 800、10 700、1 741粒，父母本与后代花粉粒差异显著。统计数据显示，2个父母本的败育花粉数不多，本研究中宁玉败育花粉数量不足10%，绿色草莓败育花粉约1 000粒，败育花粉率为10%，其子代败育花粉率大多数达到80%以上，这将决定后代结实率会极低。
3 结论与讨论
目前，研究比较多的花粉染色法为氯化三苯基四氮唑（TTC）染色测定法和碘—碘化钾染色测定法[9]，其效果不是十分明显，而且在视觉上很难辨别某些花粉是否被染色，本研究采用亚历山大染色方法，不管败育或具有生活活力的花粉均可以被染色，而且颜色对比明显，容易区分并判断活力。通过染色法研究结果表明，宁玉具有较强的花粉生活力，花粉数量多，败育花粉数少，这与实际生产中宁玉果实畸形果率低、产量高这一现象相吻合。研究报道，将八倍体栽培种草莓与二倍体草莓进行远源杂交，其父母本若正常减数分裂会得到5倍体不结实子代，育性较差[10]，而本文花粉活力检测结果显示后代败育花粉较多，与这一结论相符合。这也充分说明花粉生活力直接影响草莓的结果特性及杂交育种的成功率。本研究后期工作将通过染色体加倍试验改变后代染色体倍性，从而实现杂交后代可育性。这些新倍性材料的获得为培育10x、12x等高倍体草莓新品种、新类型带来希望，对改良现代栽培草莓的品质、抗性等有较大意义[11-15]。
4 参考文献
[1] 左丹丹，明军，刘春，等.植物花粉生活力检测技术进展[J].安徽农业科学，2007，35（16）：4742-4745.
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[3] 王壮伟，赵密珍，钱亚明，等.草莓花粉生活力的测定[J].东北农业大学学报，2010，41（3）：48-52.
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[7] ROSS PETERSON，JANET P SLOVIN，CHANGBIN CHEN.A simplified method for differential staining of aborted and non-aborted pollen grains[J].International Journal of Plant Biology，2010，1（13）：66-69.
[8] 庞夫花，赵密珍，王钰，等.草莓新品种宁玉的花粉特性研究[J].中国果树，2014（5）：27-29.
[9] 高秀岩，刘帅，满丽婷，等.草莓花粉生活力对杂交座果率的影响[J].安徽农业科学，2008，36（31）：13613-13614.
[10] 雷家军，谭昌华，代汉萍，等.草莓五倍体种间杂种的获得及回交研究[J].吉林农业大学学报，2010，32（3）：284-288.
[11] 明晓，吴璇，汉由之，等.黄毛草莓花粉活力及柱头可授性测定[J].黑龙江农业科学，2012（5）：80-82.
[12] 雷家军，范雯，王善光，等.五倍体野生草莓花粉性状及减数分裂的观察[J].沈阳农业大学学报，2009，40（4）：396-399.
[13] 时翠平.草莓属植物细胞学研究[D].保定：河北农业大学，2001.
[14] 韩柏明，赵密珍，王静，等.草莓属及其近缘属植物的花粉形态电镜观察[J].东北农业大学学报，2013（10）：104-110.
[15] 雷家军，代汉萍，邓明琴，等.草莓种间杂交的研究[J].园艺学报，2002，29（6）：519-523.