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摘要[目的]研究利用青海弧菌Q67冻干粉进行急性毒性测试的方法。[方法]通过一系列试验，探讨青海弧菌Q67冻干粉复苏及与毒物反应接触时间对毒性测试的影响，筛选出适宜青海弧菌急性毒性测试的毒性参照物，在充分借鉴国际标准ISO 11348的基础上分析现行发光抑制率计算方法的不足，提出了优化的计算方法。[结果]青海弧菌Q67冻干粉复苏的30～120 min内进行毒性测试，与毒物的反应时间控制在15～20 min时，测得数据稳定、可靠。ZnCl2适合用作青海弧菌生物急性毒性测试的毒性参照物。[结论]该研究为制定青海弧菌Q67冻干粉急性毒性测试标准提供理论依据。
关键词冻干粉；青海弧菌Q67；测试方法；急性毒性
中图分类号S94文献标识码A文章编号0517-6611（2014）15-04746-03
Abstract[Objective] The research aimed to explore the method of using Vibrio qinghaiensis sp.Q67 freezedried powder to detect acute toxicity. [Method] Through a series of tests， in this paper， Vibrio qinghaiensis sp.Q67 freezedried recovery and toxic reaction time on the influence of the toxicity test was discussed， toxicity reference substance which is suitable for acute toxicity tests with Vibrio qinghaiensis was sifted， and based on full reference to the international standard ISO 11348， analyzing the shortage using current methods to calculate luminescence inhibition rate， optimized methodology was presented. [Result] Test data will be stable and reliable when acute toxicity is detected during 30-120 min from Vibrio qinghaiensis sp.Q67 freezedried recovery and toxicity reaction time controls in 15～20 min. ZnCl2 can be used as toxicity reference in acute toxicity tests with Vibrio qinghaiensis sp.Q67. [Conclusion] The study provides the theoretical basis for creating methodological standard of using Vibrio qinghaiensis sp.Q67 freezedried powder to detect acute toxicity.
Key wordsFreezedried powder；Vibrio qinghaiensis sp.Q67； Test methods； Acute toxicity
发光细菌生物急性毒性测试法是利用一定浓度范围内，有毒物质浓度与发光细菌发光强度变化成一定比例关系，通过检测发光菌与待测物作用前后光强变化来判断待测物毒性大小的综合毒性检测方法，其灵敏度可等同于鱼类96 h急性毒性试验[1]。因其快速、灵敏、方便[2]，广泛应用于化学品[3]、污水[4]、沉积物[5]和土壤[6]等的毒性测试。然而，由于新鲜培养物的使用在现场检测时往往受到限制，采用冻干粉复苏发光细菌检测将显得非常必要。现场检测，冻干粉的复苏质量及与毒物的反应时间是保证毒性测试准确性的关键。作为我国特有的淡水发光细菌——青海弧菌Q67（Vibrio qinghaiensis sp.Q67），与海洋发光菌相比，对NaCl要求不高，pH耐受范围广，适宜淡水环境急性毒性的检测，目前已有许多学者对此进行了研究报道[7-9]，但采用青海弧菌Q67冻干粉进行急性毒性检测的方法尚不统一，限制了不同研究结果的比较，且普遍存在测试结果稳定性较差、准确度不高等问题。笔者在青海弧菌Q67现有研究的基础上，通过一系列试验，探讨冻干粉复苏、反应时间等因素对毒性检测的影响，并筛选出合适的毒性参照物，以期为制定青海弧菌Q67冻干粉急性毒性测试标准提供科学依据。
1材料与方法
1.1试验材料青海弧菌Q67冻干粉购自上海安力康科学仪器有限公司，全部试验均采用同一批制备物。ZnCl2、K2CrO7、HgCl2、CuCl2·2H2O、NaCl均采用分析纯试剂，以去离子水配制试验所需各浓度，溶液pH 6.0～8.0，满足青海弧菌对测试水样pH的要求[10]。
1.2试验仪器包括移液枪、10 ml安瓿瓶、2 ml测试玻璃管、ALK601Q水质急性毒性测试仪（上海安力康科学仪器有限公司），其中，移液枪量程200～1 000、50～200 μl，购自大龙医疗设备（上海）有限公司。
1.3试验方法实验室室内温度控制在20.0～21.0 ℃，空气相对湿度50%～60%。
1.3.1冻干粉复苏。Q67冻干粉自-20 ℃冷藏室取出置于实验室内，10 min后加入0.85%生理盐水（以下简称“复苏液”）复苏、摇匀。1支冻干粉管复苏液加入量为550 μl。 1.3.2毒性测试。测试前，以“待测水样：渗透压调节液（17%NaCl溶液）=9.5∶0.5”调节测试水样渗透压。每次测试均设3个空白对照，每个样品设置3个平行。向每根2 ml测试玻璃管注入50 μl复苏菌液，测试发光强度，记为I0；然后再于玻璃管中注入2 ml测试样，其中空白对照管注入2 ml复苏液，一定反应时间后测各玻璃管发光强度，记作IT。测试时，确保每根玻璃管反应时间一致，且每根玻璃管测试间隔时间不超过15 s。
1.4数据处理毒性计算参照ISO 11348标准[11]，引入自然变化因子fK及校正发光强度IC，以发光抑制率HT表征毒性，计算公式为：fK=空白对照IT/空白对照I0、IC=测试样I0×fK、HT=（测试样IC-测试样IT）/测试样IC×100%。引起青海弧菌发光强度衰减50%时的毒物（金属化合物）剂量EC50，即半最大效应浓度，测定时，以金属化合物浓度对青海弧菌Q67发光抑制率作图，建立线性回归方程，计算EC50值。所有数据均由Excel 2003进行处理。
2结果与分析
2.1复苏时间对青海弧菌Q67菌液发光的影响由于现场检测对时效性的要求较高，通常需提前对冻干粉复苏，而不同复苏时间可能对检测结果造成一定影响。为确定其影响程度，试验将刚添加复苏液时菌液的发光强度记为100%，其余各时刻发光强度与之作比，以百分数表示，记为各时刻“相对发光率”。由图1可知，冻干粉复苏的30～120 min内，菌液发光强度基本保持在相同水平。当复苏时间<30 min或>120 min时，发光强度随时间迅速增大或减小；发光强度变化剧烈，数据可靠性将降低。因此可认为冻干粉复苏的30～120 min内直接进行毒性测试，可得到稳定测试结果。赵洋甬等研究发现环境温度20 ℃时，Vibrio fischeri冻干粉复苏60 min后，发光强度不及初始光强的20%，且60 min内随复苏时间变化呈显著负相关[12]。与之相比，Q67冻干粉有30～120 min的发光稳定期，且复苏210 min后衰减发光强度尚能达到初始光强的60%，说明青海弧菌Q67复苏菌液活性更强，有利于在现场急性毒性检测中获得稳定、可靠的测试结果。
2.3毒性参照物的筛选现行标准方法用作毒性参照物的HgCl2具有很强毒性，不仅实验过程中对实验人员的健康不利，进入环境后将进一步危害人类健康及生态环境。为此，笔者试图筛选出更安全的参照物代替HgCl2。除HgCl2外，在此选取3种常见的金属化合物CuCl2、K2Cr2O7、ZnCl2，在相同试验条件下（冻干粉复苏时间60 min，复苏菌液与金属化合物反应时间15 min），通过测定EC50值，得到它们的毒性大小为HgCl2（EC50=0.03 mg/L）>ZnCl2（EC50=0.58 mg/L）>CuCl2（EC50=1.89 mg/L）>K2Cr2O7（EC50=3.83 mg/L）（表1），即HgCl2显示了最强毒性，ZnCl2和CuCl2毒性次之，此顺序与王丽莎等的报道较为一致[13]。一般认为金属的毒性与其和硫的亲和力有关，金属与硫的亲和力越强，对有机体的毒性就越大（如Cu）[8]，但青海弧菌Q67所表现出来的行为不同，其机制有待进一步研究。
由表1可知，线性回归方程的R2值均在0.98以上（P<0.01），因此，试验中各重金属化合物样品浓度与青海弧菌Q67复苏菌液发光抑制率之间线性关系良好。超出线性范围，毒物浓度对青海弧菌Q67发光抑制率影响无显著性差别，而HgCl2线性范围最小，在毒性测试中这将不利于以HgCl2进行浓度毒性当量评价；CuCl2、K2Cr2O7线性范围较大，但两者溶液均有颜色，为毒性测试带来色度干扰，产生附加的发光抑制读数[14]。以各金属化合物的上述EC50浓度进行3次毒性测试，发现CuCl2、K2Cr2O7 、HgCl2三者的毒性稳定性不及ZnCl2（表2）。
3结论
（1）青海弧菌Q67冻干粉复苏的30～120 min内直接进行毒性测试，有利于得到稳定的检测结果；以Q67冻干粉进行毒性测试时复苏菌液与被测样品的反应时间应控制在不超过30 min，考虑到应急监测筛查效率的高效性，将15～20 min作为毒性判别的反应时间更为合理。
（2）通过一系列试验的筛选，发现ZnCl2易溶、稳定、价廉、常见，毒性大小适中，对人体和环境的影响小，适合用作青海弧菌生物急性毒性测试的毒性参照物。
（3）发光抑制率的计算中，引入自然变化因子fK，并以此校正因发光细菌自身发光强度的变化所产生的误差，所得数据能更稳定、可靠地反应测试毒物的毒性大小。
（4）该试验均在20 ℃温度条件下进行，而现场急性毒性测试时，温度变化不会保持稳定，青海弧菌的适应温度范围广（10～30 ℃）[10]，但温度变化易引起发光菌生物酶活性的变化，从而影响毒性测试结果。因此研究环境因子变化对青海弧菌生理特性的影响，细化并综合不同测试条件下毒性测试方法，将是今后研究工作的重点，对解决当前发光细菌急性毒性测试中出现的测试结果重复性、再现性较差且准确度不高等问题有重要意义。
参考文献
[1] 方战强，陈中豪，胡勇有.发光细菌法在水质监测中的应用[J].重庆环境科学，2003，25（2）：56-58.
[2] 黄正，王家玲.发光细菌的生理特性及其在环境监测中的应用[J].环境科学，1994，16（3）：87-90.
[3] ELALAWI Y S，MCCONKEY B J，DIXON D G，et al.Measurement of short and longterm toxicity of policyclic aromatic hydrocarbons using luminescent bacteria [J].Ecotoxicol Environ Safety，2002，51（1）：12-21. [4] 顾宗濂，谢思琴，吴留松，等.用生物发光计测定污染水体生物毒性[J].环境科学，1983，4（5）：30-33.
[5] JOHNSON T B，LONG E R.Rapid toxicity assessment of sediments from estuarine ecosystems：A new tandem in vitro testing approach [J].Environ Toxicol Chem，1998，17（6）：1099-1106.
[6] 李彬，李培军，王晶，等.重金属污染土壤毒性的发光菌法诊断[J].应用生态学报，2001，12（3）：443-446.
[7] 马晓妍，闫志刚，刘永军，等.污水的青海弧菌Q67生物毒性检测及影响因素分析[J].环境科学，2011，32（6）：1632-1637.
[8] 刘清，马梅，童中华，等.Cu、Zn、Cd、Hg对青海弧菌（Q67菌株）联合毒性作用的研究[J].中国环境科学，1997，17（4）：301-303.
[9] 林志芬，于红霞，许士奋，等.发光菌生物毒性测试方法的改进[J].环境科学，2001，22（2）：114-117.
[10] 朱文杰，郑天凌，李伟民.发光细菌与环境毒性检测[M].北京：中国轻工业出版社，2009：99-101，175-1777.
[11] Water qualityDetermination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri （Luminescent bacteria test）-Part 3：Method using freeze-dried bacteria（ISO 11348-3：2007）[S].2007.
[12] 赵洋甬，胡建林，邵立军.发光菌毒性测试的影响因子研究[J].现代科学仪器，2010（3）：75-78.
[13] 王丽莎，魏东斌，胡洪营.发光细菌毒性测试条件的优化与毒性参照物的选择[J].环境科学研究，2004，17（4）：61-66.
[14] LAPPALAINEN J，JUVONEN R，VAAJASAARI K，et al.A new flash method for measuring the toxicity of solid and colored samples [J].Chemosphere，1999，38（5）：1069-1083.
[15] 中国科学院南京土壤研究所.GB/T 15441-1995，水质急性毒性的测定发光细菌法[S].北京：中国标准出版社，1996.
[16] 马勇，黄燕，贾玉玲，等.发光细菌急性毒性测试方法的优化研究[J].环境污染与防治，2010，32（11）：48-52.
关键词冻干粉；青海弧菌Q67；测试方法；急性毒性
中图分类号S94文献标识码A文章编号0517-6611（2014）15-04746-03
Abstract[Objective] The research aimed to explore the method of using Vibrio qinghaiensis sp.Q67 freezedried powder to detect acute toxicity. [Method] Through a series of tests， in this paper， Vibrio qinghaiensis sp.Q67 freezedried recovery and toxic reaction time on the influence of the toxicity test was discussed， toxicity reference substance which is suitable for acute toxicity tests with Vibrio qinghaiensis was sifted， and based on full reference to the international standard ISO 11348， analyzing the shortage using current methods to calculate luminescence inhibition rate， optimized methodology was presented. [Result] Test data will be stable and reliable when acute toxicity is detected during 30-120 min from Vibrio qinghaiensis sp.Q67 freezedried recovery and toxicity reaction time controls in 15～20 min. ZnCl2 can be used as toxicity reference in acute toxicity tests with Vibrio qinghaiensis sp.Q67. [Conclusion] The study provides the theoretical basis for creating methodological standard of using Vibrio qinghaiensis sp.Q67 freezedried powder to detect acute toxicity.
Key wordsFreezedried powder；Vibrio qinghaiensis sp.Q67； Test methods； Acute toxicity
发光细菌生物急性毒性测试法是利用一定浓度范围内，有毒物质浓度与发光细菌发光强度变化成一定比例关系，通过检测发光菌与待测物作用前后光强变化来判断待测物毒性大小的综合毒性检测方法，其灵敏度可等同于鱼类96 h急性毒性试验[1]。因其快速、灵敏、方便[2]，广泛应用于化学品[3]、污水[4]、沉积物[5]和土壤[6]等的毒性测试。然而，由于新鲜培养物的使用在现场检测时往往受到限制，采用冻干粉复苏发光细菌检测将显得非常必要。现场检测，冻干粉的复苏质量及与毒物的反应时间是保证毒性测试准确性的关键。作为我国特有的淡水发光细菌——青海弧菌Q67（Vibrio qinghaiensis sp.Q67），与海洋发光菌相比，对NaCl要求不高，pH耐受范围广，适宜淡水环境急性毒性的检测，目前已有许多学者对此进行了研究报道[7-9]，但采用青海弧菌Q67冻干粉进行急性毒性检测的方法尚不统一，限制了不同研究结果的比较，且普遍存在测试结果稳定性较差、准确度不高等问题。笔者在青海弧菌Q67现有研究的基础上，通过一系列试验，探讨冻干粉复苏、反应时间等因素对毒性检测的影响，并筛选出合适的毒性参照物，以期为制定青海弧菌Q67冻干粉急性毒性测试标准提供科学依据。
1材料与方法
1.1试验材料青海弧菌Q67冻干粉购自上海安力康科学仪器有限公司，全部试验均采用同一批制备物。ZnCl2、K2CrO7、HgCl2、CuCl2·2H2O、NaCl均采用分析纯试剂，以去离子水配制试验所需各浓度，溶液pH 6.0～8.0，满足青海弧菌对测试水样pH的要求[10]。
1.2试验仪器包括移液枪、10 ml安瓿瓶、2 ml测试玻璃管、ALK601Q水质急性毒性测试仪（上海安力康科学仪器有限公司），其中，移液枪量程200～1 000、50～200 μl，购自大龙医疗设备（上海）有限公司。
1.3试验方法实验室室内温度控制在20.0～21.0 ℃，空气相对湿度50%～60%。
1.3.1冻干粉复苏。Q67冻干粉自-20 ℃冷藏室取出置于实验室内，10 min后加入0.85%生理盐水（以下简称“复苏液”）复苏、摇匀。1支冻干粉管复苏液加入量为550 μl。 1.3.2毒性测试。测试前，以“待测水样：渗透压调节液（17%NaCl溶液）=9.5∶0.5”调节测试水样渗透压。每次测试均设3个空白对照，每个样品设置3个平行。向每根2 ml测试玻璃管注入50 μl复苏菌液，测试发光强度，记为I0；然后再于玻璃管中注入2 ml测试样，其中空白对照管注入2 ml复苏液，一定反应时间后测各玻璃管发光强度，记作IT。测试时，确保每根玻璃管反应时间一致，且每根玻璃管测试间隔时间不超过15 s。
1.4数据处理毒性计算参照ISO 11348标准[11]，引入自然变化因子fK及校正发光强度IC，以发光抑制率HT表征毒性，计算公式为：fK=空白对照IT/空白对照I0、IC=测试样I0×fK、HT=（测试样IC-测试样IT）/测试样IC×100%。引起青海弧菌发光强度衰减50%时的毒物（金属化合物）剂量EC50，即半最大效应浓度，测定时，以金属化合物浓度对青海弧菌Q67发光抑制率作图，建立线性回归方程，计算EC50值。所有数据均由Excel 2003进行处理。
2结果与分析
2.1复苏时间对青海弧菌Q67菌液发光的影响由于现场检测对时效性的要求较高，通常需提前对冻干粉复苏，而不同复苏时间可能对检测结果造成一定影响。为确定其影响程度，试验将刚添加复苏液时菌液的发光强度记为100%，其余各时刻发光强度与之作比，以百分数表示，记为各时刻“相对发光率”。由图1可知，冻干粉复苏的30～120 min内，菌液发光强度基本保持在相同水平。当复苏时间<30 min或>120 min时，发光强度随时间迅速增大或减小；发光强度变化剧烈，数据可靠性将降低。因此可认为冻干粉复苏的30～120 min内直接进行毒性测试，可得到稳定测试结果。赵洋甬等研究发现环境温度20 ℃时，Vibrio fischeri冻干粉复苏60 min后，发光强度不及初始光强的20%，且60 min内随复苏时间变化呈显著负相关[12]。与之相比，Q67冻干粉有30～120 min的发光稳定期，且复苏210 min后衰减发光强度尚能达到初始光强的60%，说明青海弧菌Q67复苏菌液活性更强，有利于在现场急性毒性检测中获得稳定、可靠的测试结果。
2.3毒性参照物的筛选现行标准方法用作毒性参照物的HgCl2具有很强毒性，不仅实验过程中对实验人员的健康不利，进入环境后将进一步危害人类健康及生态环境。为此，笔者试图筛选出更安全的参照物代替HgCl2。除HgCl2外，在此选取3种常见的金属化合物CuCl2、K2Cr2O7、ZnCl2，在相同试验条件下（冻干粉复苏时间60 min，复苏菌液与金属化合物反应时间15 min），通过测定EC50值，得到它们的毒性大小为HgCl2（EC50=0.03 mg/L）>ZnCl2（EC50=0.58 mg/L）>CuCl2（EC50=1.89 mg/L）>K2Cr2O7（EC50=3.83 mg/L）（表1），即HgCl2显示了最强毒性，ZnCl2和CuCl2毒性次之，此顺序与王丽莎等的报道较为一致[13]。一般认为金属的毒性与其和硫的亲和力有关，金属与硫的亲和力越强，对有机体的毒性就越大（如Cu）[8]，但青海弧菌Q67所表现出来的行为不同，其机制有待进一步研究。
由表1可知，线性回归方程的R2值均在0.98以上（P<0.01），因此，试验中各重金属化合物样品浓度与青海弧菌Q67复苏菌液发光抑制率之间线性关系良好。超出线性范围，毒物浓度对青海弧菌Q67发光抑制率影响无显著性差别，而HgCl2线性范围最小，在毒性测试中这将不利于以HgCl2进行浓度毒性当量评价；CuCl2、K2Cr2O7线性范围较大，但两者溶液均有颜色，为毒性测试带来色度干扰，产生附加的发光抑制读数[14]。以各金属化合物的上述EC50浓度进行3次毒性测试，发现CuCl2、K2Cr2O7 、HgCl2三者的毒性稳定性不及ZnCl2（表2）。
3结论
（1）青海弧菌Q67冻干粉复苏的30～120 min内直接进行毒性测试，有利于得到稳定的检测结果；以Q67冻干粉进行毒性测试时复苏菌液与被测样品的反应时间应控制在不超过30 min，考虑到应急监测筛查效率的高效性，将15～20 min作为毒性判别的反应时间更为合理。
（2）通过一系列试验的筛选，发现ZnCl2易溶、稳定、价廉、常见，毒性大小适中，对人体和环境的影响小，适合用作青海弧菌生物急性毒性测试的毒性参照物。
（3）发光抑制率的计算中，引入自然变化因子fK，并以此校正因发光细菌自身发光强度的变化所产生的误差，所得数据能更稳定、可靠地反应测试毒物的毒性大小。
（4）该试验均在20 ℃温度条件下进行，而现场急性毒性测试时，温度变化不会保持稳定，青海弧菌的适应温度范围广（10～30 ℃）[10]，但温度变化易引起发光菌生物酶活性的变化，从而影响毒性测试结果。因此研究环境因子变化对青海弧菌生理特性的影响，细化并综合不同测试条件下毒性测试方法，将是今后研究工作的重点，对解决当前发光细菌急性毒性测试中出现的测试结果重复性、再现性较差且准确度不高等问题有重要意义。
参考文献
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[5] JOHNSON T B，LONG E R.Rapid toxicity assessment of sediments from estuarine ecosystems：A new tandem in vitro testing approach [J].Environ Toxicol Chem，1998，17（6）：1099-1106.
[6] 李彬，李培军，王晶，等.重金属污染土壤毒性的发光菌法诊断[J].应用生态学报，2001，12（3）：443-446.
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[16] 马勇，黄燕，贾玉玲，等.发光细菌急性毒性测试方法的优化研究[J].环境污染与防治，2010，32（11）：48-52.