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[摘 要]目的 建立健脾增肥片中橙皮苷的测定方法。方法 采用HPLC法,色谱柱:KromasilC18柱(4.6mm×250mm,5μm),流动相为甲醇醋酸水(体积比35∶4∶61),柱溫为室温,流速为1.0 mL·min-1,检测波长为283nm。结果 橙皮苷在0.3008~2.1056μg范围与峰面积呈良好线性关系(r=0.9999,n=7),平均回收率为101.68%,RSD为1.45%。结论 该方法精密度高、重现性好,可用于健脾增肥片的质量控制。
[关键词]健脾增肥片;橙皮苷;HPLC法
中图分类号:S859.79+7文献标识码:A文章编号:1009-914X(2013)21-0249-01
健脾增肥片由白术、黄芪、陈皮等十三味药材制成,具有补气、健脾、安神的功效,主要用于胃口呆滞、发育不良、体重减轻、睡眠不宁等。本方重用白术为君药,黄芪补气固表、止汗脱毒,陈皮理气健脾、调中、燥湿,共为方中臣药。陈皮含有陈皮素、橙皮苷、新橙皮苷等成分,其中橙皮苷具有较强的生物活性,文献也多用橙皮苷作为药材或制剂的检测指标。为了利于健脾增肥片的市场推广,本研究采用HPLC法测定该制剂中橙皮苷的含量,在参考2005年版《中国药典》基础上加以改进,大大缩短了测定周期。经方法学验证,所建立的方法分析快速、准确、灵敏度高、重现性好,可用于健脾增肥片中橙皮苷的含量测定,为建立健脾增肥片科学、可行的质控标准提供依据。
1 仪器与试药
Waters高效液相色谱仪(2487型DAD检测器),KromasilC18柱(4.6mm×250mm,5μm);德国BP211D Sartorius电子天平(十万分之一);橙皮苷对照品(批号0721200010)购自中国药品生物制品检定所;健脾增肥片(自制,批号090326、090411、090606);甲醇为色谱纯;水为重蒸水;其它试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 溶液的制备
2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取橙皮苷对照品适量,置量瓶中,用甲醇溶解并稀释制成每1mL中含75.2μg的溶液,摇匀,0.2μm微孔滤膜滤过,即得。
2.1.2 供试品溶液的制备 取本品研细,称取细粉约1g,精密称定,置具塞三角瓶中,精密移入甲醇25mL,精密称重,超声90min,取出,放冷至室温,以甲醇补足重量,摇匀,0.2μm微孔滤膜滤过,即得。
2.1.3 阴性对照液的制备 取处方组成中除陈皮外的其余各味药材,按健脾增肥片生产工艺制成缺陈皮的阴性对照品,按“2.1.2”项下的方法制备得阴性对照液。
2.2 色谱条件及系统适用性试验
色谱柱:Kromasil C18柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相:甲醇 醋酸 水(体积比35∶4∶61);流速:1.0mL·min-1;检测波长:283nm。分别取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照液10μL注入液相色谱仪,橙皮苷的保留时间约为20. 1min,理论塔板数以橙皮苷峰计不低于5 000,橙皮苷与其他物质可基线分离,且阴性对照液无干扰。
2.3 线性关系考察
分别精密吸取橙皮苷对照品溶液4、8、12、16、20、24、28 μL,注入液相色谱仪,记录峰面积。以峰面积(Y)为纵坐标,橙皮苷进样量(X)为横坐标,进行线性回归,得回归方程为Y=1507500 X-11112,r=0.999 9(n=7),表明橙皮苷在0.300 8~2.105 6μg范围内呈良好的线性关系。
2.4 精密度试验
精密吸取对照品溶液10μL,连续进样6次,峰面积的RSD为0.73%,表明仪器精密度良好。
2.5 稳定性试验
取健脾增肥片(批号090326),按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液,分别在0、0.5、1、1.5、2、3、4、5、6 h进样10 μL,记录峰面积。结果峰面积的RSD为1. 48%,表明供试品溶液在6 h内稳定,可满足测定需要。
2.6 重复性试验
取同一批号样品(批号090326)样品6份,按“2.1.2”项下方法制备并进行测定,经外标法计算,橙皮苷平均含量为4.253 mg·g-1,RSD为0.38%,结果表明本方法具有较好的重复性。
2.7 加样回收率试验
取已知含量的健脾增肥片(批号:090326)0.5g,精密称定,共6份,分别精密加入橙皮苷对照品储备液(每1 mL中含橙皮苷0.504mg)5.0mL,精密移入甲醇20 mL,依法测定,橙皮苷平均加样回收率为101.68%,RSD1.45%。
2.8 样品含量测定
取3批健脾增肥片(090326、090411、090606),按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液,分别进样10μL,记录峰面积,外标法计算橙皮苷的含量,结果3个批号样品的含量分别为4.253、4.145、4.075 mg·g-1。
3 讨论
(1)将超声提取法与2005年版《中国药典》(一部)[1]收载的陈皮药材含量测定项下索氏提取法进行了比较,结果发现药典方法耗费时间很长(共约12 h),提取效率却比超声法低;而且索氏提取法制成的供试品溶液颜色较深,提示其提取的杂质亦较多,故选用超声法进行提取。同时考察了超声提取30、60、90 min橙皮苷的提取效率,结果表明,超声不同时间的提取率有明显差异,超声时间越长,橙皮苷提取效率越高。因此确定供试品溶液提取方法为超声提取90 min。
(2)白术为本方君药,具有健脾益气、燥湿利水、止汗、安胎等功效,含有挥发油、白术内酯等成分。有学者研究了白术或含白术的复方制剂中苍术酮、白术内酯的含量,但所采用的苍术酮、白术内酯等对照品均为实验室自制,不被中国药品生物制品检定所对照品目录收载,故作为建立质量标准使用并不合适。黄芪为方中臣药,具有补气固表、利尿托毒等功效,黄芪甲苷为其主要药效成分,也是含量测定常用的指标成分之一。但药典中黄芪甲苷的测定方法供试液制备步骤繁琐,需经多次有机相水相液液萃取,不利于成本控制和环境保护,且黄芪甲苷色谱峰存在不明杂质的干扰。故本研究选用另一臣药陈皮中橙皮苷作为指标成分进行含量测定,具有操作步骤简单、避免使用有毒溶剂的优点。
(3)由样品含量测定结果可知,3批次健脾增肥片中橙皮苷含量接近,说明健脾增肥片的原料性质、制备工艺均比较稳定,制剂质量可控性高。用本法测定健脾增肥片中橙皮苷的含量,方法简单、重现性较好,便于推广。
参考文献
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:2005年版一部[M].北京:化学工业出版社,2005:132,212.
[2] 关宏峰,刘晓秋,兰洲,等.HPLC法同时测定中药柳穿鱼中柳穿鱼苷和橙皮苷的含量[J].沈阳药科大学学报,2009,26(2):119-122.
[3] 鄢燕,汤宏敏,饶毅,等.多波长高效液相色谱法测定血府逐瘀口服液中5种有效成分[J].药物分析杂志,2009,29(3):347-350.
[关键词]健脾增肥片;橙皮苷;HPLC法
中图分类号:S859.79+7文献标识码:A文章编号:1009-914X(2013)21-0249-01
健脾增肥片由白术、黄芪、陈皮等十三味药材制成,具有补气、健脾、安神的功效,主要用于胃口呆滞、发育不良、体重减轻、睡眠不宁等。本方重用白术为君药,黄芪补气固表、止汗脱毒,陈皮理气健脾、调中、燥湿,共为方中臣药。陈皮含有陈皮素、橙皮苷、新橙皮苷等成分,其中橙皮苷具有较强的生物活性,文献也多用橙皮苷作为药材或制剂的检测指标。为了利于健脾增肥片的市场推广,本研究采用HPLC法测定该制剂中橙皮苷的含量,在参考2005年版《中国药典》基础上加以改进,大大缩短了测定周期。经方法学验证,所建立的方法分析快速、准确、灵敏度高、重现性好,可用于健脾增肥片中橙皮苷的含量测定,为建立健脾增肥片科学、可行的质控标准提供依据。
1 仪器与试药
Waters高效液相色谱仪(2487型DAD检测器),KromasilC18柱(4.6mm×250mm,5μm);德国BP211D Sartorius电子天平(十万分之一);橙皮苷对照品(批号0721200010)购自中国药品生物制品检定所;健脾增肥片(自制,批号090326、090411、090606);甲醇为色谱纯;水为重蒸水;其它试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 溶液的制备
2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取橙皮苷对照品适量,置量瓶中,用甲醇溶解并稀释制成每1mL中含75.2μg的溶液,摇匀,0.2μm微孔滤膜滤过,即得。
2.1.2 供试品溶液的制备 取本品研细,称取细粉约1g,精密称定,置具塞三角瓶中,精密移入甲醇25mL,精密称重,超声90min,取出,放冷至室温,以甲醇补足重量,摇匀,0.2μm微孔滤膜滤过,即得。
2.1.3 阴性对照液的制备 取处方组成中除陈皮外的其余各味药材,按健脾增肥片生产工艺制成缺陈皮的阴性对照品,按“2.1.2”项下的方法制备得阴性对照液。
2.2 色谱条件及系统适用性试验
色谱柱:Kromasil C18柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相:甲醇 醋酸 水(体积比35∶4∶61);流速:1.0mL·min-1;检测波长:283nm。分别取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照液10μL注入液相色谱仪,橙皮苷的保留时间约为20. 1min,理论塔板数以橙皮苷峰计不低于5 000,橙皮苷与其他物质可基线分离,且阴性对照液无干扰。
2.3 线性关系考察
分别精密吸取橙皮苷对照品溶液4、8、12、16、20、24、28 μL,注入液相色谱仪,记录峰面积。以峰面积(Y)为纵坐标,橙皮苷进样量(X)为横坐标,进行线性回归,得回归方程为Y=1507500 X-11112,r=0.999 9(n=7),表明橙皮苷在0.300 8~2.105 6μg范围内呈良好的线性关系。
2.4 精密度试验
精密吸取对照品溶液10μL,连续进样6次,峰面积的RSD为0.73%,表明仪器精密度良好。
2.5 稳定性试验
取健脾增肥片(批号090326),按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液,分别在0、0.5、1、1.5、2、3、4、5、6 h进样10 μL,记录峰面积。结果峰面积的RSD为1. 48%,表明供试品溶液在6 h内稳定,可满足测定需要。
2.6 重复性试验
取同一批号样品(批号090326)样品6份,按“2.1.2”项下方法制备并进行测定,经外标法计算,橙皮苷平均含量为4.253 mg·g-1,RSD为0.38%,结果表明本方法具有较好的重复性。
2.7 加样回收率试验
取已知含量的健脾增肥片(批号:090326)0.5g,精密称定,共6份,分别精密加入橙皮苷对照品储备液(每1 mL中含橙皮苷0.504mg)5.0mL,精密移入甲醇20 mL,依法测定,橙皮苷平均加样回收率为101.68%,RSD1.45%。
2.8 样品含量测定
取3批健脾增肥片(090326、090411、090606),按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液,分别进样10μL,记录峰面积,外标法计算橙皮苷的含量,结果3个批号样品的含量分别为4.253、4.145、4.075 mg·g-1。
3 讨论
(1)将超声提取法与2005年版《中国药典》(一部)[1]收载的陈皮药材含量测定项下索氏提取法进行了比较,结果发现药典方法耗费时间很长(共约12 h),提取效率却比超声法低;而且索氏提取法制成的供试品溶液颜色较深,提示其提取的杂质亦较多,故选用超声法进行提取。同时考察了超声提取30、60、90 min橙皮苷的提取效率,结果表明,超声不同时间的提取率有明显差异,超声时间越长,橙皮苷提取效率越高。因此确定供试品溶液提取方法为超声提取90 min。
(2)白术为本方君药,具有健脾益气、燥湿利水、止汗、安胎等功效,含有挥发油、白术内酯等成分。有学者研究了白术或含白术的复方制剂中苍术酮、白术内酯的含量,但所采用的苍术酮、白术内酯等对照品均为实验室自制,不被中国药品生物制品检定所对照品目录收载,故作为建立质量标准使用并不合适。黄芪为方中臣药,具有补气固表、利尿托毒等功效,黄芪甲苷为其主要药效成分,也是含量测定常用的指标成分之一。但药典中黄芪甲苷的测定方法供试液制备步骤繁琐,需经多次有机相水相液液萃取,不利于成本控制和环境保护,且黄芪甲苷色谱峰存在不明杂质的干扰。故本研究选用另一臣药陈皮中橙皮苷作为指标成分进行含量测定,具有操作步骤简单、避免使用有毒溶剂的优点。
(3)由样品含量测定结果可知,3批次健脾增肥片中橙皮苷含量接近,说明健脾增肥片的原料性质、制备工艺均比较稳定,制剂质量可控性高。用本法测定健脾增肥片中橙皮苷的含量,方法简单、重现性较好,便于推广。
参考文献
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:2005年版一部[M].北京:化学工业出版社,2005:132,212.
[2] 关宏峰,刘晓秋,兰洲,等.HPLC法同时测定中药柳穿鱼中柳穿鱼苷和橙皮苷的含量[J].沈阳药科大学学报,2009,26(2):119-122.
[3] 鄢燕,汤宏敏,饶毅,等.多波长高效液相色谱法测定血府逐瘀口服液中5种有效成分[J].药物分析杂志,2009,29(3):347-350.