【摘 要】
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目的:构建大鼠野生型早期生长应答基因-1(early growth response gene-1,Egr-1)及其特异性短发夹状小干涉RNA(shRNA)真核表达质粒,并观察Egr-1在大鼠肾小球系膜细胞(GMC)中过
【机 构】
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南京医科大学微生物与免疫学系,江苏南京,210029
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目的:构建大鼠野生型早期生长应答基因-1(early growth response gene-1,Egr-1)及其特异性短发夹状小干涉RNA(shRNA)真核表达质粒,并观察Egr-1在大鼠肾小球系膜细胞(GMC)中过表达及沉默Egr-1基因的情况.方法:用DNA重组技术将针对大鼠Egr-1基因的CDS区序列和针对其不同位点所设计的3对shRNA序列分别克隆到真核表达质粒pcDNA3.1-mychis-A和pGCsi.U6.neo.GFP中.经酶切分析及序列测定正确后,用GenEscortTM Ⅲ转染试剂将上述两种质粒分别转染至大鼠GMC中,随后进行Western blot检测Egr-1蛋白的表达及筛选最佳沉默效率的shRNA.结果:限制性内切酶酶切及核酸序列分析证明,两种重组质粒均构建正确.Western blot分析表明,构建的peDNA3.1/Egr-1质粒在大鼠GMC中能够表达;Egr-1 shRNA-2具有最佳沉默效率.结论:成功构建了大鼠野生型Egr-1基因和其特异性的shRNA真核表达质粒,为进一步研究Egr-1基因的生物学功能提供了必要的实验工具.
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