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摘 要: 目的：建立一种简便、灵敏、特异的DNA检测方法。方法：用荧光偏振技术检测102例乙型肝炎患者血清中的HBV DNA，并与多聚酶链反应一酶联免疫吸附试验(PCR-ELISA)方法作比较。结果：该方法可以检测出1×101拷贝的HBV DNA模板，CV 为6.44%，对102例乙型肝炎患者的血清进行检测，HBsAg(+)、HBeAg(+)、抗HBc(+)血清HBV DNA 阳性率为100%；HBsAg(+)、抗HBe(+)、抗HBc(+)血清HBV DNA阳性率为81.8%；HBsAg(+)、抗HBc(+)血清HBV DNA阳性率为72.4%，其余为阴性。30例非乙型肝炎患者血清中HBV DNA的检测结果均为阴性。结论：该方法简单、灵敏、特异，适用于临床进行大样本核酸检测。
关键词: 乙型肝炎病毒 脱氧核糖核酸 多聚酶链反应 荧光偏振 检测
资料与方法
主要仪器和试剂：MJ Research V2.0；Victor Ⅱ荧光偏振检测仪；dNTPs、Taq DNA聚合酶。引物和探针：PCR引物源于HBV DNA C区：Ncbi Genbank：(AY123041.1 GI：22415734)。C1(1901-1920)：5'-TGGAGCTTCTGTGGAGTTAC-3'；C2(2160-2141)：5'-GGAGTGCGAATCCACACTCC-3'；探针(1846-1832)：5'-AAAGAAGTCAGAAGG-R110-3'。血清标本：102例已确诊的乙型肝炎患者血清，30例已确诊非乙型肝炎患者血清。
血清处理：煮沸法，具体操作步骤见文献［1］。
PCR扩增反应和液相杂交［2］：取2μl模板加到28μ1 PCR反应液中(10×PCR缓冲液3μ1，dNTPs各160μmol/L，上游通用引物C1和下游通用引物C2各3pmol，探针1.5pmol，Taq DNA聚合酶1U)。PCR程序：94℃ 2分钟后进入循环，94℃ 5秒，60℃ 55秒，72℃ 45秒，循环25次，最后94℃ 5秒，45℃ 20秒。
探针杂交［3］：取10μ1杂交后的PCR产物加入含有45μ1杂交液［其中含1g／L聚乙二醇4000，300ml/L DMSO，6×SSC(pH 10)，0.01mol/L磷酸钠(pH 8.0)，1mmol/I.EDTA(pH 8.0)，5g/L SDS，100fg/ml变性鲑鱼精DNA，5g/L脱脂奶粉］的用于荧光偏振检测的微孔中，混匀后40℃水浴放置10分钟，然后用VictorⅡ荧光偏振检测仪检测荧光素R110的偏振值。
判定标准：随机选10份HBV DNA阴性血清和10份HBV DNA阳性血清进行检测，cut off值=阴性样本结果的平均偏振光值+10%×阳性样本结果的平均偏振光值。偏振光值>cut off值×110%的样本为阳性，
结 果
PCR反应体系中探针浓度的确定：PCR反应液中探针浓度分别为50、5、0.5和0.05 μmol/L。分别对模板数为5×101拷贝的阳性对照和阴性对照进行PCR扩增和杂交，结果探针浓度为0.5～5μmol/L时均能检测阴阳性对照。当探针浓度偏低(0.05μmol/L)和偏高(50μmol/L)时，检测结果出现假阴性和假阳性，因此最终探针浓度确定为0.5μmol/L。
PCR-FP的最低检出量：对HBV DNA拷贝数分别为1×101、1×102、1×103和1×104拷贝及阴性对照进行检测，结果该方法可以检测到1×101 拷贝的模板。偏振光值分别为72、95、132、184和44mp(阴性)。
重复性实验：用PCR-FP对一个HBV DNA阳性样本重复检测10次，偏振光值分别为115、110、97、117、96、105、98、109、108和113mp，CV=6.44%。
PCR-FP与PCR-ELISA比较：用2种方法对102例乙型肝炎患者的血清进行检测，PCR-FP检测方法对HBsAg(+)、HBeAg(+)、抗HBc(+)的血清检出率为100%(40/40)；HBsAg(+)、抗HBe(+)、抗HBc(+)的血清检出率为81.8%(27/33)；HBsAg(+)、抗HBc(+)血清检出率为72.4%(21/29)。而30例非乙型肝炎患者的血清PCR-FP检验结果均为阴性。
讨 论
PCR-ELISA分3个主要步骤，第1个步骤是PCR扩增，第2个是PCR产物和探针的杂交过程，第3个是ELISA检测。而PCR-FP方法将上述第1和第2步合二为一，因此PCR扩增和探针液相杂交在同一管中进行，即将探针直接加到PCR反应液中，随PCR反应一同完成。由于探针的3'端为ddUTP-R110，使得探针不能被延伸；另外探针的退火温度为40℃，而PCR引物的退火温度为60℃。因此，在PCR过程中，荧光标记探针无法与模板结合，不会影响PCR反应。PCR反应结束，荧光标记探针则与PCR产物上相应区域结合，形成杂交双链。在反应体系中加入杂交液可使产物双链DNA的退火温度降低至40℃下，可使非特异的杂交探针解离，提高了探针与产物杂交的特异性。由于荧光素和双链DNA相连，相对分子质量明显增大，从而使荧光偏振增大，而游离探针上荧光素的荧光偏振光不增加，由此仪器可以将特异杂交双链检测出来。
我们的方法目前需要解决的问题：PCR扩增用的微孔板与荧光偏振光检测用的微孔板尚不能通用，PCR扩增产物必须手工转移到荧光偏振光检测用微孔板中，因此操作仍存在麻烦之处，也存在污染的可能，需要采取防污染的措施。但是，我们的方法与PCR-ELISA相比，实现了扩增与杂交一体化，简化了操作步骤，缩短了整个实验的时间。
参考文献
1 Guo YH,Yan J,Meng XR,et al.A quantitive PCR kit used in automatic genetic amplification instrument.J Fourth Mil Med Univ,2001,22:1349-1351.
2 Dieffenbach CW,Dveksler GS.PCR primer a laboratory manual.USA:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1995:143-153.
关键词: 乙型肝炎病毒 脱氧核糖核酸 多聚酶链反应 荧光偏振 检测
资料与方法
主要仪器和试剂：MJ Research V2.0；Victor Ⅱ荧光偏振检测仪；dNTPs、Taq DNA聚合酶。引物和探针：PCR引物源于HBV DNA C区：Ncbi Genbank：(AY123041.1 GI：22415734)。C1(1901-1920)：5'-TGGAGCTTCTGTGGAGTTAC-3'；C2(2160-2141)：5'-GGAGTGCGAATCCACACTCC-3'；探针(1846-1832)：5'-AAAGAAGTCAGAAGG-R110-3'。血清标本：102例已确诊的乙型肝炎患者血清，30例已确诊非乙型肝炎患者血清。
血清处理：煮沸法，具体操作步骤见文献［1］。
PCR扩增反应和液相杂交［2］：取2μl模板加到28μ1 PCR反应液中(10×PCR缓冲液3μ1，dNTPs各160μmol/L，上游通用引物C1和下游通用引物C2各3pmol，探针1.5pmol，Taq DNA聚合酶1U)。PCR程序：94℃ 2分钟后进入循环，94℃ 5秒，60℃ 55秒，72℃ 45秒，循环25次，最后94℃ 5秒，45℃ 20秒。
探针杂交［3］：取10μ1杂交后的PCR产物加入含有45μ1杂交液［其中含1g／L聚乙二醇4000，300ml/L DMSO，6×SSC(pH 10)，0.01mol/L磷酸钠(pH 8.0)，1mmol/I.EDTA(pH 8.0)，5g/L SDS，100fg/ml变性鲑鱼精DNA，5g/L脱脂奶粉］的用于荧光偏振检测的微孔中，混匀后40℃水浴放置10分钟，然后用VictorⅡ荧光偏振检测仪检测荧光素R110的偏振值。
判定标准：随机选10份HBV DNA阴性血清和10份HBV DNA阳性血清进行检测，cut off值=阴性样本结果的平均偏振光值+10%×阳性样本结果的平均偏振光值。偏振光值>cut off值×110%的样本为阳性，
结 果
PCR反应体系中探针浓度的确定：PCR反应液中探针浓度分别为50、5、0.5和0.05 μmol/L。分别对模板数为5×101拷贝的阳性对照和阴性对照进行PCR扩增和杂交，结果探针浓度为0.5～5μmol/L时均能检测阴阳性对照。当探针浓度偏低(0.05μmol/L)和偏高(50μmol/L)时，检测结果出现假阴性和假阳性，因此最终探针浓度确定为0.5μmol/L。
PCR-FP的最低检出量：对HBV DNA拷贝数分别为1×101、1×102、1×103和1×104拷贝及阴性对照进行检测，结果该方法可以检测到1×101 拷贝的模板。偏振光值分别为72、95、132、184和44mp(阴性)。
重复性实验：用PCR-FP对一个HBV DNA阳性样本重复检测10次，偏振光值分别为115、110、97、117、96、105、98、109、108和113mp，CV=6.44%。
PCR-FP与PCR-ELISA比较：用2种方法对102例乙型肝炎患者的血清进行检测，PCR-FP检测方法对HBsAg(+)、HBeAg(+)、抗HBc(+)的血清检出率为100%(40/40)；HBsAg(+)、抗HBe(+)、抗HBc(+)的血清检出率为81.8%(27/33)；HBsAg(+)、抗HBc(+)血清检出率为72.4%(21/29)。而30例非乙型肝炎患者的血清PCR-FP检验结果均为阴性。
讨 论
PCR-ELISA分3个主要步骤，第1个步骤是PCR扩增，第2个是PCR产物和探针的杂交过程，第3个是ELISA检测。而PCR-FP方法将上述第1和第2步合二为一，因此PCR扩增和探针液相杂交在同一管中进行，即将探针直接加到PCR反应液中，随PCR反应一同完成。由于探针的3'端为ddUTP-R110，使得探针不能被延伸；另外探针的退火温度为40℃，而PCR引物的退火温度为60℃。因此，在PCR过程中，荧光标记探针无法与模板结合，不会影响PCR反应。PCR反应结束，荧光标记探针则与PCR产物上相应区域结合，形成杂交双链。在反应体系中加入杂交液可使产物双链DNA的退火温度降低至40℃下，可使非特异的杂交探针解离，提高了探针与产物杂交的特异性。由于荧光素和双链DNA相连，相对分子质量明显增大，从而使荧光偏振增大，而游离探针上荧光素的荧光偏振光不增加，由此仪器可以将特异杂交双链检测出来。
我们的方法目前需要解决的问题：PCR扩增用的微孔板与荧光偏振光检测用的微孔板尚不能通用，PCR扩增产物必须手工转移到荧光偏振光检测用微孔板中，因此操作仍存在麻烦之处，也存在污染的可能，需要采取防污染的措施。但是，我们的方法与PCR-ELISA相比，实现了扩增与杂交一体化，简化了操作步骤，缩短了整个实验的时间。
参考文献
1 Guo YH,Yan J,Meng XR,et al.A quantitive PCR kit used in automatic genetic amplification instrument.J Fourth Mil Med Univ,2001,22:1349-1351.
2 Dieffenbach CW,Dveksler GS.PCR primer a laboratory manual.USA:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1995:143-153.