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摘要：本实验建立了淀粉及其制品中顺丁烯二酸和顺丁烯二酸酐总量的检测方法，样品用乙醇水溶液超声提取，经过碱解离心以及C18填料净化，液相色谱检测。方法操作简便，具有可靠的灵敏度和稳定性，适用于食品中顺丁烯二酸和顺丁烯二酸酐总量的测定。
关键词：液相色谱 淀粉 食品 马来酸 顺丁烯二酸
中图分类号：TS207.3 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2014）12-0033-02
顺丁烯二酸酐，又名马来酸酐，是重要的有机化工原料，广泛应用于改性淀粉。顺丁烯二酸酐遇水即水解为顺丁烯二酸，二者均为非食品添加剂，对狗肾小管有损伤，对人体细胞可能有毒性[1-2]。但是顺丁烯二酸（酐）加入淀粉后可提高食品口感，延长保存期，而且价格低廉，常被不法商家滥用。
我国大陆地区目前没有检测食品中顺丁烯二酸（酐）的国家标准，已发表的顺丁烯二酸的检测方法有化学法、液相色谱法等，其中化学法的检出限高，但定量不准确；色谱法主要应用于空气、化工合成产物或单纯的方法开发[3-6]，食品中仅有淀粉及淀粉制品中顺丁烯二酸（酐）的检测[7-9]，其它食品样品尚未见报道。本实验针对常见淀粉及其制品，对前处理和仪器方法进行了系统研究，建立了适用于食品中顺丁烯二酸和顺丁烯二酸酐总含量测定的高效液相色谱分析方法，方法可靠，操作简单，便于推广。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
LC20A高压液相色谱仪（日本岛津公司）：四元泵，具有可变波长的紫外检测器和数据处理系统；
SK-1快速混匀器（常州国华电器有限公司）；
DL-500A超声波清洗仪（40KHZ，上海之信仪器有限公司）；
顺丁烯二酸标准品（纯度大于99%，Sigma公司）；
实验样品：小麦淀粉，玉米淀粉，红薯淀粉，复合淀粉，红薯粉丝，鱼丸，关东煮，方便面等均购于市场；
甲醇（色谱级），磷酸（优级纯），无水乙醇（分析纯），国药试剂有限公司。
1.2 标准溶液的配制
称取顺丁烯二酸酐0.0500g，用水溶解定容至100mL容量瓶中，配成500mg/L的标准储备液，4℃冷藏 使用前以5%乙醇水溶液配制成0.1，0.5，5，20，50，100mg/L等系列标准溶液。
1.3 色谱条件
色谱柱：Diamonsil C18 4.6×250 mm 5μm
流动相：甲醇/0.1%磷酸溶液=2/98
流速：0.6 mL/min
柱温：35 ℃
检测波长：220 nm（或214nm）
进样量：20μL
1.4 样品前处理
不含油脂样品：取2.50g（精确至0.01 g）于50mL容量瓶，加入30mL乙醇-水（5：95，v：v）混合溶液，涡旋2min，超声提取10min；加入10.0mL0.5mol/L的KOH溶液，充分混匀后静置30min；加入1mL5mol/L的盐酸溶液，混匀（PH3～5即可），去离子水定容；4000r/min 离心5min，取上清液过0.45μm滤膜，待测。
含油脂样品：取2.50 g同上；定容后取2mL上清液入5mL离心管，加0.1g C18填料，混匀后10000 r/min离心5 min，取上清液过0.45μm滤膜，待测。
1.5 定量方法
由于顺丁烯二酸酐遇水即水解，在提取后实际测得的目标物为顺丁烯二酸，故本方法以顺丁烯二酸为标准品采用外标法定量，对食品中的顺丁烯二酸和顺丁烯二酸酐总含量以顺丁烯二酸计。
2 结果和讨论
2.1 提取剂的选择
在水中加入一定比例的无水乙醇时，由于降低了提取液的极性，提取效果有了较显著的改善。无水乙醇的体积分数为5%～40%时，提取效果无显著差异。由于顺丁烯二酸为水溶性强极性化合物，所以乙醇体积分数超过50%时，色谱峰形逐渐变差，目标峰开始不对称，并形成分叉峰，同时提取率也开始下降，如图1。综合考虑，本方法选择5%乙醇水溶液作为提取剂。
2.2 超声提取时间和次数的影响
以5%乙醇水溶液为提取溶液，比较超声提取时间和次数对提取效果的影响，结果发现，超声提取5，10，20，30，60min时，提取效果无显著差异，如图2。由于顺丁烯二酸酐遇水即水解，且在水中溶解度大，所以在提取过程中，超声时间对提取率的影响不显著，短时间内可获得较好的提取效果。为达到充分提取的目的，本实验选择超声提取10min。
2.3 净化方法的选择
提取液直接过膜上机，目标化合物干扰严重，回收率也不理想；多次调节PH则可能费工费时。本实验通过碱解离心，含油脂样品则进一步通过C18填料吸附，消除了大部分干扰物质，净化效果比较理想。
2.4 色谱条件的确定
参考GB/T 23296.21-2009，比较甲醇、乙腈不同比例的0.1%磷酸溶液，发现以甲醇/0.1%磷酸溶液（2/98）为流动相，目标化合物在Diamonsil C18 4.6×250 mm 5μm色谱柱上峰形对称，保留时间适中，能够很好地和杂质分离。
2.5 线性和检出限
按照1.2配置顺丁烯二酸标准溶液，以1.3中色谱条件进样后，以标准溶液浓度为X轴，以峰面积为Y轴建立标准曲线：Y=68842X+396.85，相关系数r=0.9999。以10倍噪音为定量限；则样品定量限为2mg/kg。
2.6 回收率和精密度
取不同淀粉及其制品，添加不同浓度的顺丁烯二酸，按照实验方法平行测定，结果如表1所示，回收率回收率80%～110%，RSD%在0.148%～7.83%之间。
3 结语
本实验建立了淀粉及其制品中顺丁烯二酸和顺丁烯二酸酐总量的检测方法，样品用乙醇水溶液超声提取，经过碱解离心以及C18填料净化，液相色谱检测。方法操作简便，具有可靠的灵敏度和稳定性，适用于食品中顺丁烯二酸和顺丁烯二酸酐总量的测定。
参考文献
[1]Mutation Research.（Elsevier Science Pub. B.V.， POB 211，1000 AE Amsterdam， Netherlands） V.1- 1964-：183，89，987.
[2]BIOFAX Industrial Bio-Test Laboratories，Inc.， Data Sheets.（1810 Frontage Rd.，Northbrook，IL 60062） ：7-4/1970.
[3]肖玲.顺丁烯二酸酐含量测定研究[J].化工技术与开发，2005，（06）：45-46.
[4]项苏留，吴建军，陆振荣，路建美.马来酸酐与二苄基马来酸酯共存体系的荧光分析法研究[J].分析测试学报，1997，（02）：42-46.
[5]李金昶，赫奕，孙颜，王广，崔秀君.用反相高效液相色谱法分离和测定丁烯二酸的顺反异构体[J]. 分析测试学报，2000，（02）：72-74.
[6]金瓯.离子对色谱法同时测定富马酸甲酯、富马酸二甲酯、富马酸和顺丁烯二酸酐[J].光谱实验室， 2007，（04）： 695-698.
[7]GB/T 23296.21-2009.食品接触材料 高分子材料 食品模拟物中顺丁烯二酸及顺丁烯二酸酐的测定 高效液相色谱法.北京：中国标准出版社），2009[S].
[8]食品中顺丁烯二酸与顺丁烯二酸酐总量之检验方法.（台）卫生署，2013-05-27[S].
[9]陈健，林真，张玉燕，钱疆，蔡少立，杨方.食品中马来酸的高压液相色谱法检测研究[J].食品安全质量检测学报，2013，4（5）：1499-1504.
关键词：液相色谱 淀粉 食品 马来酸 顺丁烯二酸
中图分类号：TS207.3 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2014）12-0033-02
顺丁烯二酸酐，又名马来酸酐，是重要的有机化工原料，广泛应用于改性淀粉。顺丁烯二酸酐遇水即水解为顺丁烯二酸，二者均为非食品添加剂，对狗肾小管有损伤，对人体细胞可能有毒性[1-2]。但是顺丁烯二酸（酐）加入淀粉后可提高食品口感，延长保存期，而且价格低廉，常被不法商家滥用。
我国大陆地区目前没有检测食品中顺丁烯二酸（酐）的国家标准，已发表的顺丁烯二酸的检测方法有化学法、液相色谱法等，其中化学法的检出限高，但定量不准确；色谱法主要应用于空气、化工合成产物或单纯的方法开发[3-6]，食品中仅有淀粉及淀粉制品中顺丁烯二酸（酐）的检测[7-9]，其它食品样品尚未见报道。本实验针对常见淀粉及其制品，对前处理和仪器方法进行了系统研究，建立了适用于食品中顺丁烯二酸和顺丁烯二酸酐总含量测定的高效液相色谱分析方法，方法可靠，操作简单，便于推广。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
LC20A高压液相色谱仪（日本岛津公司）：四元泵，具有可变波长的紫外检测器和数据处理系统；
SK-1快速混匀器（常州国华电器有限公司）；
DL-500A超声波清洗仪（40KHZ，上海之信仪器有限公司）；
顺丁烯二酸标准品（纯度大于99%，Sigma公司）；
实验样品：小麦淀粉，玉米淀粉，红薯淀粉，复合淀粉，红薯粉丝，鱼丸，关东煮，方便面等均购于市场；
甲醇（色谱级），磷酸（优级纯），无水乙醇（分析纯），国药试剂有限公司。
1.2 标准溶液的配制
称取顺丁烯二酸酐0.0500g，用水溶解定容至100mL容量瓶中，配成500mg/L的标准储备液，4℃冷藏 使用前以5%乙醇水溶液配制成0.1，0.5，5，20，50，100mg/L等系列标准溶液。
1.3 色谱条件
色谱柱：Diamonsil C18 4.6×250 mm 5μm
流动相：甲醇/0.1%磷酸溶液=2/98
流速：0.6 mL/min
柱温：35 ℃
检测波长：220 nm（或214nm）
进样量：20μL
1.4 样品前处理
不含油脂样品：取2.50g（精确至0.01 g）于50mL容量瓶，加入30mL乙醇-水（5：95，v：v）混合溶液，涡旋2min，超声提取10min；加入10.0mL0.5mol/L的KOH溶液，充分混匀后静置30min；加入1mL5mol/L的盐酸溶液，混匀（PH3～5即可），去离子水定容；4000r/min 离心5min，取上清液过0.45μm滤膜，待测。
含油脂样品：取2.50 g同上；定容后取2mL上清液入5mL离心管，加0.1g C18填料，混匀后10000 r/min离心5 min，取上清液过0.45μm滤膜，待测。
1.5 定量方法
由于顺丁烯二酸酐遇水即水解，在提取后实际测得的目标物为顺丁烯二酸，故本方法以顺丁烯二酸为标准品采用外标法定量，对食品中的顺丁烯二酸和顺丁烯二酸酐总含量以顺丁烯二酸计。
2 结果和讨论
2.1 提取剂的选择
在水中加入一定比例的无水乙醇时，由于降低了提取液的极性，提取效果有了较显著的改善。无水乙醇的体积分数为5%～40%时，提取效果无显著差异。由于顺丁烯二酸为水溶性强极性化合物，所以乙醇体积分数超过50%时，色谱峰形逐渐变差，目标峰开始不对称，并形成分叉峰，同时提取率也开始下降，如图1。综合考虑，本方法选择5%乙醇水溶液作为提取剂。
2.2 超声提取时间和次数的影响
以5%乙醇水溶液为提取溶液，比较超声提取时间和次数对提取效果的影响，结果发现，超声提取5，10，20，30，60min时，提取效果无显著差异，如图2。由于顺丁烯二酸酐遇水即水解，且在水中溶解度大，所以在提取过程中，超声时间对提取率的影响不显著，短时间内可获得较好的提取效果。为达到充分提取的目的，本实验选择超声提取10min。
2.3 净化方法的选择
提取液直接过膜上机，目标化合物干扰严重，回收率也不理想；多次调节PH则可能费工费时。本实验通过碱解离心，含油脂样品则进一步通过C18填料吸附，消除了大部分干扰物质，净化效果比较理想。
2.4 色谱条件的确定
参考GB/T 23296.21-2009，比较甲醇、乙腈不同比例的0.1%磷酸溶液，发现以甲醇/0.1%磷酸溶液（2/98）为流动相，目标化合物在Diamonsil C18 4.6×250 mm 5μm色谱柱上峰形对称，保留时间适中，能够很好地和杂质分离。
2.5 线性和检出限
按照1.2配置顺丁烯二酸标准溶液，以1.3中色谱条件进样后，以标准溶液浓度为X轴，以峰面积为Y轴建立标准曲线：Y=68842X+396.85，相关系数r=0.9999。以10倍噪音为定量限；则样品定量限为2mg/kg。
2.6 回收率和精密度
取不同淀粉及其制品，添加不同浓度的顺丁烯二酸，按照实验方法平行测定，结果如表1所示，回收率回收率80%～110%，RSD%在0.148%～7.83%之间。
3 结语
本实验建立了淀粉及其制品中顺丁烯二酸和顺丁烯二酸酐总量的检测方法，样品用乙醇水溶液超声提取，经过碱解离心以及C18填料净化，液相色谱检测。方法操作简便，具有可靠的灵敏度和稳定性，适用于食品中顺丁烯二酸和顺丁烯二酸酐总量的测定。
参考文献
[1]Mutation Research.（Elsevier Science Pub. B.V.， POB 211，1000 AE Amsterdam， Netherlands） V.1- 1964-：183，89，987.
[2]BIOFAX Industrial Bio-Test Laboratories，Inc.， Data Sheets.（1810 Frontage Rd.，Northbrook，IL 60062） ：7-4/1970.
[3]肖玲.顺丁烯二酸酐含量测定研究[J].化工技术与开发，2005，（06）：45-46.
[4]项苏留，吴建军，陆振荣，路建美.马来酸酐与二苄基马来酸酯共存体系的荧光分析法研究[J].分析测试学报，1997，（02）：42-46.
[5]李金昶，赫奕，孙颜，王广，崔秀君.用反相高效液相色谱法分离和测定丁烯二酸的顺反异构体[J]. 分析测试学报，2000，（02）：72-74.
[6]金瓯.离子对色谱法同时测定富马酸甲酯、富马酸二甲酯、富马酸和顺丁烯二酸酐[J].光谱实验室， 2007，（04）： 695-698.
[7]GB/T 23296.21-2009.食品接触材料 高分子材料 食品模拟物中顺丁烯二酸及顺丁烯二酸酐的测定 高效液相色谱法.北京：中国标准出版社），2009[S].
[8]食品中顺丁烯二酸与顺丁烯二酸酐总量之检验方法.（台）卫生署，2013-05-27[S].
[9]陈健，林真，张玉燕，钱疆，蔡少立，杨方.食品中马来酸的高压液相色谱法检测研究[J].食品安全质量检测学报，2013，4（5）：1499-1504.