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摘要：以芒果基因组DNA为模板，采用正交试验对模板DNA含量、引物浓度、2×Taq CR Master Mix含量进行3因素5水平正交试验优化。结果表明，相关序列扩增多态性CR（sequence related amplified polymorphism，SRA-CR）最佳反应体系为：30 ng 模板DNA、03 μmol/L 引物、0 μL 2×Taq CR Master Mix，总体积为25 μL。运用该体系对0份芒果种质材料进行验证，证明该体系稳定可靠，并从00对引物组合中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的36对引物组合。
关键词：芒果；SRA标记；正交试验设计；体系优化；引物筛选
中图分类号： Q9432；S667703文献标志码： A
文章编号：002-302（204）2-004-03
芒果（Mangifera indica L）为漆树科常绿果树，是著名的热带亚热带水果，享有“热带果王”之美誉，为世界五大名果之一。近年来由于我国芒果种质资源的深入挖掘利用以及芒果育种的进步，特别是国外引进品种的增多，芒果种质资源日益丰富，为芒果的品种创新奠定了坚实的基础，同时也对芒果遗传多样性鉴定和新品种测试与保护工作提出了新的挑战。
相关序列扩增多态性（sequence related amplified polymorphism，SRA）是Li等于200年发明的一种新的标记技术。该技术集随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAD）和扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFL）技术的优点于一体，具有简单、稳定、在基因组中分布均匀等优点。目前已应用于苹果、柑橘类果树、樱桃、大蒜、棉花、水稻、澳洲坚果[2]、菠萝、桃、花生[3]、番木瓜[4]等，但至今尚未见SRA分子标记应用于我国芒果遗传多样性分析、分类鉴定等方面的报道。[3]笔者在开展芒果遗传多样性及其亲缘关系研究的过程中发现，SRA-CR条件的变化会得到不同的结果，影响芒果的遗传多样性评价，因此构建适用于芒果的SRA-CR体系至关重要。
[3]本试验以0份芒果种质为材料，借鉴其他作物的研究成果，就影响芒果SRA-CR反应的因素进行探索，建立了适合芒果SRA分析的反应条件及体系，旨在为芒果种质资源鉴定和创新、分子标记辅助育种等提供技术帮助，为近一步开展芒果种质资源遗传多样性研究及遗传连锁图谱的构建奠定基础。
材料与方法
试验材料
参试芒果种质共0份，均采自广西亚热带作物研究所芒果种质资源圃。选取芒果健康植株上的无病虫嫩叶，采摘洗净后于-70 ℃保存，反应体系的优化以金煌芒DNA为模板完成，供试品种见表。
2试验方法
2DNA的提取和检测芒果基因组DNA的提取参照何新华等的CTAB法[5]，并稍加改良，利用0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，根据样品D260 nm/D280 nm计算DNA纯度，根据D260 nm值计算样品DNA的浓度，并稀释至0 ng/μL，于-20 ℃保存备用。
22SRA-CR反应条件参考Li等所用引物[，6]，设计0条正向引物和0条反向引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表2）。选用引物Me9与Em9进行体系优化，试验重复2次。扩增程序：94 ℃预变性 min，35 ℃退火 min，72 ℃延伸5 min，5个循环；94 ℃预变性 min，50 ℃ 退火 min，72 ℃ 延伸 5 min，35个循环；72 ℃延伸0 min，4 ℃保存备用。CR产物用20%琼脂糖凝胶在 05×TBE 电泳缓冲液中、85 W条件下电泳5 h，采用核酸染料染色法进行条带检测。电泳结束后，于凝胶成像系统上检测并拍照，依照扩增条带的敏感性与特异性，即条带的强弱及杂带的多少来判断各体系的优劣。
24优化体系的稳定性检测及引物筛选随机选择6对SRA引物组合对优化体系进行验证，确定芒果SRA-CR的最佳反应体系和扩增条件，并对00条引物组合进行CR扩增，筛选多态性引物。
2结果与分析
2芒果基因组DNA的检测结果
DNA的提取质量是决定SRA-CR扩增效果的关键因素之一。本试验以芒果嫩叶为材料，对0份芒果种质材料的基因组DNA 进行提取，最后得到的DNA呈透明絮状，电泳后条带清晰，无拖尾现象（图）。经分光光度计测定，所用DNA样品的D260 nm/D230 nm值均在20～25之间，D260 nm/D280 nm 值均在7～9之间，表明所提取的DNA质量较高，符合试验要求。
[FK（W0][TZYtif][FK）]
22正交试验设计的SRA-CR扩增结果分析
由图2可见，25个芒果正交试验处理的SRA-CR扩增结果存在着一定的差异。从2次重复试验的结果来看，、6、0、4、5、22号处理谱带少且不清晰，4、5、8、9、2、3与7号组合的谱[2]带清晰，亮度、重复性好。综合扩增条带的数目、强弱、清晰度、可分辩率与节约成本等指标，确定组合8号是比较理想的扩增模式体系，即25 μL反应体系中含30 ng DNA，03 μmol/L 引物，25 μL 2×Taq CR Master Mix。
23引物筛选
以随机选取的芒果DNA作模板，用00对引物进行CR扩增，从中选择扩增条带清晰、稳定且多态性高的适合芒果种质鉴定的引物进行正式扩增。根据扩增条带的多少、清晰度、稳定性和多态性高低，最终从所合成的00对引物中筛选出36对引物用于SRA扩增（表5）。
24SRA 优化体系在不同芒果种间的扩增
根据上述试验的优化结果，随机选取Me6与Em引物组合来对0份芒果种质的DNA进行扩增，以进一步验证该扩增反应体系的效果。由图3可以看出，引物Me6与Em不 但对0份芒果种质均能扩增出较好的条带，而且也存在着很明显[CM（25]的多态性条带，由此说明所优化的扩增体系比较可靠，适合芒果种质的SRA分析研究。
3结论与讨论
CR反应体系的优化方法主要有3种：单因素试验、均匀试验和正交试验优化。正交试验设计相对单因素试验而言具有试验次数较少、效用明确且能较快地获得极佳的试验结果的特点，避免了单一因素试验结果的不足。目前，正交试验设计已成功应用于枣、价廉草、花生、番石榴等植物的 SRA-CR 反应体系优化[7]，但在芒果上还未曾见报道。本试验通过正交设计，对影响芒果SRA 反应体系的模板DNA含量、引物浓度、2×Taq CR Master Mix含量进行了优化，建立了适用于芒果的最优SRA反应体系，即25μL反应体系中包含30 ng 模板DNA、03μmol/L 引物、0μL 2×Taq CR Master Mix。同时，在00个引物组合中，共得到多态性引物组合36个。该反应体系及36个多态性引物组合可用于芒果种质遗传多样性分析、系统发育和育种应用等方面，同时也为芒果品种鉴定、亲缘关系分析及优良新品种的选育等提供技术参考。
影响SRA-CR反应的因素相对复杂，不同植物适应的SRA 反应体系不同，且各因素之间存在着相互效应，只有各因子之间的浓度配比达到最佳状态时才能得到稳定、可重复的扩增结果。因此，SRA标记应用到不同物种上时需要优化反应体系和条件。在芒果SRA 体系优化的过程中，发现DNA模板含量、2×Taq CR Master Mix含量及引物浓度等均会影响SRA扩增效果，但模板DNA含量对扩增无明显影响（20～60 ng 之间均有稳定的扩增），这与其他学者的研究结果相似[2，8-0]。可见，对芒果SRA 反应条件进行优化是非常必要的。
[HS2][HT85H]参考文献：[HT8SS]
[ZK（#]Li G，Quiros C F Sequence-related amplified polymorpgism （SRA） a new marker system based on a simple CR reaction：its application to mapping and gene tagging in BrassicaTheoretical and Applied Genetics，200，03（2/3）：455-46
[2]郭凌飞，邹明宏，杜丽清，等 均匀设计优化澳洲坚果SRA反应体系 果树学报，2008，25（2）：250-253
[3]邱文武，孙伟生，窦美安 菠萝SRA反应体系的建立及优化 生物技术，2008，8（）：39-42
[4]韦金菊，何凡，范鸿雁，等 番木瓜DNA提取与SRA反应体系优化 中国南方果树，200，39（）：33-36
[5]何新华，李杨瑞，郭永泽，等 23个广西本地芒果品种的ISSR分析 分子植物育种，2005，3（6）：829-834
[6][2]Ahmad R，otter D，Southwick S M Genotyping of peach and nectarine cultivars with SSR and SRA molecular markers ournal of the American Society for Horticultural Science，2004，29（2）：204-20
[7]杨祥燕，蔡元保，陈豪军，等 番石榴SRA反应体系的建立与正交优化 中国农学通报，20，27（22）：29-223
[8]Budak H，Shearman R C，armaksiz I，et al Comparative analysis of seeded and vegetative biotype buffalograsses based on phylogenetic relationship using ISSRs，SSRs，RADs，and SRAs Theoretical and Applied Genetics，2004，09（2）：280-288
[9]刘冲，葛才林，任云英，等 SRA、ISSR技术的优化及在甘蓝类植物种子鉴别中的应用 生物工程学报，2006，22（4）：657-66[ZK）]
[0][ZK（#]路娟，张绍铃，刘庆忠，等 樱桃SRA-CR体系优化及其遗传多样性分析 果树学报，2009，26（2）：63-69
关键词：芒果；SRA标记；正交试验设计；体系优化；引物筛选
中图分类号： Q9432；S667703文献标志码： A
文章编号：002-302（204）2-004-03
芒果（Mangifera indica L）为漆树科常绿果树，是著名的热带亚热带水果，享有“热带果王”之美誉，为世界五大名果之一。近年来由于我国芒果种质资源的深入挖掘利用以及芒果育种的进步，特别是国外引进品种的增多，芒果种质资源日益丰富，为芒果的品种创新奠定了坚实的基础，同时也对芒果遗传多样性鉴定和新品种测试与保护工作提出了新的挑战。
相关序列扩增多态性（sequence related amplified polymorphism，SRA）是Li等于200年发明的一种新的标记技术。该技术集随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAD）和扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFL）技术的优点于一体，具有简单、稳定、在基因组中分布均匀等优点。目前已应用于苹果、柑橘类果树、樱桃、大蒜、棉花、水稻、澳洲坚果[2]、菠萝、桃、花生[3]、番木瓜[4]等，但至今尚未见SRA分子标记应用于我国芒果遗传多样性分析、分类鉴定等方面的报道。[3]笔者在开展芒果遗传多样性及其亲缘关系研究的过程中发现，SRA-CR条件的变化会得到不同的结果，影响芒果的遗传多样性评价，因此构建适用于芒果的SRA-CR体系至关重要。
[3]本试验以0份芒果种质为材料，借鉴其他作物的研究成果，就影响芒果SRA-CR反应的因素进行探索，建立了适合芒果SRA分析的反应条件及体系，旨在为芒果种质资源鉴定和创新、分子标记辅助育种等提供技术帮助，为近一步开展芒果种质资源遗传多样性研究及遗传连锁图谱的构建奠定基础。
材料与方法
试验材料
参试芒果种质共0份，均采自广西亚热带作物研究所芒果种质资源圃。选取芒果健康植株上的无病虫嫩叶，采摘洗净后于-70 ℃保存，反应体系的优化以金煌芒DNA为模板完成，供试品种见表。
2试验方法
2DNA的提取和检测芒果基因组DNA的提取参照何新华等的CTAB法[5]，并稍加改良，利用0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，根据样品D260 nm/D280 nm计算DNA纯度，根据D260 nm值计算样品DNA的浓度，并稀释至0 ng/μL，于-20 ℃保存备用。
22SRA-CR反应条件参考Li等所用引物[，6]，设计0条正向引物和0条反向引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表2）。选用引物Me9与Em9进行体系优化，试验重复2次。扩增程序：94 ℃预变性 min，35 ℃退火 min，72 ℃延伸5 min，5个循环；94 ℃预变性 min，50 ℃ 退火 min，72 ℃ 延伸 5 min，35个循环；72 ℃延伸0 min，4 ℃保存备用。CR产物用20%琼脂糖凝胶在 05×TBE 电泳缓冲液中、85 W条件下电泳5 h，采用核酸染料染色法进行条带检测。电泳结束后，于凝胶成像系统上检测并拍照，依照扩增条带的敏感性与特异性，即条带的强弱及杂带的多少来判断各体系的优劣。
24优化体系的稳定性检测及引物筛选随机选择6对SRA引物组合对优化体系进行验证，确定芒果SRA-CR的最佳反应体系和扩增条件，并对00条引物组合进行CR扩增，筛选多态性引物。
2结果与分析
2芒果基因组DNA的检测结果
DNA的提取质量是决定SRA-CR扩增效果的关键因素之一。本试验以芒果嫩叶为材料，对0份芒果种质材料的基因组DNA 进行提取，最后得到的DNA呈透明絮状，电泳后条带清晰，无拖尾现象（图）。经分光光度计测定，所用DNA样品的D260 nm/D230 nm值均在20～25之间，D260 nm/D280 nm 值均在7～9之间，表明所提取的DNA质量较高，符合试验要求。
[FK（W0][TZYtif][FK）]
22正交试验设计的SRA-CR扩增结果分析
由图2可见，25个芒果正交试验处理的SRA-CR扩增结果存在着一定的差异。从2次重复试验的结果来看，、6、0、4、5、22号处理谱带少且不清晰，4、5、8、9、2、3与7号组合的谱[2]带清晰，亮度、重复性好。综合扩增条带的数目、强弱、清晰度、可分辩率与节约成本等指标，确定组合8号是比较理想的扩增模式体系，即25 μL反应体系中含30 ng DNA，03 μmol/L 引物，25 μL 2×Taq CR Master Mix。
23引物筛选
以随机选取的芒果DNA作模板，用00对引物进行CR扩增，从中选择扩增条带清晰、稳定且多态性高的适合芒果种质鉴定的引物进行正式扩增。根据扩增条带的多少、清晰度、稳定性和多态性高低，最终从所合成的00对引物中筛选出36对引物用于SRA扩增（表5）。
24SRA 优化体系在不同芒果种间的扩增
根据上述试验的优化结果，随机选取Me6与Em引物组合来对0份芒果种质的DNA进行扩增，以进一步验证该扩增反应体系的效果。由图3可以看出，引物Me6与Em不 但对0份芒果种质均能扩增出较好的条带，而且也存在着很明显[CM（25]的多态性条带，由此说明所优化的扩增体系比较可靠，适合芒果种质的SRA分析研究。
3结论与讨论
CR反应体系的优化方法主要有3种：单因素试验、均匀试验和正交试验优化。正交试验设计相对单因素试验而言具有试验次数较少、效用明确且能较快地获得极佳的试验结果的特点，避免了单一因素试验结果的不足。目前，正交试验设计已成功应用于枣、价廉草、花生、番石榴等植物的 SRA-CR 反应体系优化[7]，但在芒果上还未曾见报道。本试验通过正交设计，对影响芒果SRA 反应体系的模板DNA含量、引物浓度、2×Taq CR Master Mix含量进行了优化，建立了适用于芒果的最优SRA反应体系，即25μL反应体系中包含30 ng 模板DNA、03μmol/L 引物、0μL 2×Taq CR Master Mix。同时，在00个引物组合中，共得到多态性引物组合36个。该反应体系及36个多态性引物组合可用于芒果种质遗传多样性分析、系统发育和育种应用等方面，同时也为芒果品种鉴定、亲缘关系分析及优良新品种的选育等提供技术参考。
影响SRA-CR反应的因素相对复杂，不同植物适应的SRA 反应体系不同，且各因素之间存在着相互效应，只有各因子之间的浓度配比达到最佳状态时才能得到稳定、可重复的扩增结果。因此，SRA标记应用到不同物种上时需要优化反应体系和条件。在芒果SRA 体系优化的过程中，发现DNA模板含量、2×Taq CR Master Mix含量及引物浓度等均会影响SRA扩增效果，但模板DNA含量对扩增无明显影响（20～60 ng 之间均有稳定的扩增），这与其他学者的研究结果相似[2，8-0]。可见，对芒果SRA 反应条件进行优化是非常必要的。
[HS2][HT85H]参考文献：[HT8SS]
[ZK（#]Li G，Quiros C F Sequence-related amplified polymorpgism （SRA） a new marker system based on a simple CR reaction：its application to mapping and gene tagging in BrassicaTheoretical and Applied Genetics，200，03（2/3）：455-46
[2]郭凌飞，邹明宏，杜丽清，等 均匀设计优化澳洲坚果SRA反应体系 果树学报，2008，25（2）：250-253
[3]邱文武，孙伟生，窦美安 菠萝SRA反应体系的建立及优化 生物技术，2008，8（）：39-42
[4]韦金菊，何凡，范鸿雁，等 番木瓜DNA提取与SRA反应体系优化 中国南方果树，200，39（）：33-36
[5]何新华，李杨瑞，郭永泽，等 23个广西本地芒果品种的ISSR分析 分子植物育种，2005，3（6）：829-834
[6][2]Ahmad R，otter D，Southwick S M Genotyping of peach and nectarine cultivars with SSR and SRA molecular markers ournal of the American Society for Horticultural Science，2004，29（2）：204-20
[7]杨祥燕，蔡元保，陈豪军，等 番石榴SRA反应体系的建立与正交优化 中国农学通报，20，27（22）：29-223
[8]Budak H，Shearman R C，armaksiz I，et al Comparative analysis of seeded and vegetative biotype buffalograsses based on phylogenetic relationship using ISSRs，SSRs，RADs，and SRAs Theoretical and Applied Genetics，2004，09（2）：280-288
[9]刘冲，葛才林，任云英，等 SRA、ISSR技术的优化及在甘蓝类植物种子鉴别中的应用 生物工程学报，2006，22（4）：657-66[ZK）]
[0][ZK（#]路娟，张绍铃，刘庆忠，等 樱桃SRA-CR体系优化及其遗传多样性分析 果树学报，2009，26（2）：63-69