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【摘 要】目的：以现有的潲水油实时荧光定量PCR鉴定方法为基础，建立微滴式数字PCR检测方法，提高潲水油鉴定的灵敏度。方法：利用微滴式数字PCR技术对潲水油样品进行检测，样品为来源确定的潲水油与正常植物油经不同浓度配比稀释。结果：微滴式数字PCR检出限低于实时荧光定量PCR，且通过多次重复检测的方法可以进一步提高检出限。结论：微滴式数字PCR方法比现行实时荧光定量PCR方法灵敏度有所提高，结果判定更准确，假阴性率降低。
【关键词】潲水油；微滴式数字PCR；动物源性基因；实时荧光定量PCR
【中图分类号】R-3 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）05-0022-02
Primary application study of droplet digital PCR in identifying hogwash oil
Li Hao， Yang Dong-Yan， Yang Yong-cun， Zhang Qian， Geng Yi-jie， Deng Ping-jian*
（Shenzhen Center for Disease Control and Prevention， Shenzhen 518055， China）
【Abstract】Objective：Establish the identification method for hogwash oil identification by droplet digital PCR （ddPCR） based on current real-time quantitative PCR （RT-qPCR） method， to improve the sensitivity. Methods：Hogwash oil samples from confirmed origins are mixed with normal edible plant oil by different proportions， and the mixed samples are tested by droplet digital PCR. Results：All samples can be identified by droplet digital PCR method except the extremely low concentration （with hogwash oil ≤10%）. Conclusion：Compared to the current RT-qPCR， the droplet digital PCR could improve the sensitivity and reduce the false negative rates to provide more accurate results.
【Key words】hogwash oil； ddPCR； animal-specific gene； RT-qPCR
近年來，全国不少地方发现了用餐厨废弃物提炼生产的潲水油（俗称地沟油），经非法渠道回流到餐桌，带来严重食品安全隐患，群众对此反映强烈，引起社会广泛关注[1]。本课题组自2008年以来开展研究以基因为标志物检测潲水油的方法。先后选用的标志物包括猪、牛、羊、鸡、米、麦、马铃薯、辣椒等动物和植物的基因片段。建立了油样中核酸的提取和富集方法和标志物的实时荧光定量PCR扩增检测方法[2-4]。该方法的特异性优于利用理化指标鉴定潲水油的方法。在适用性方面，动物基因作为标志物的最大优势在于它能适用于以各种原料、工艺和条件提炼生产的潲水油的检测。2011年9月至今，本课题组已接受本地公安部门和食安办送检的疑似潲水油样本95份，部分样本的标志物检测结果为强阳性。
动物基因标志物存在的问题是其检测敏感度不足。虽然，基于基因片段的PCR技术是目前对生物内源性成分检测敏感性最高的技术，可实现对超微量的靶基因的指数扩增和检测。但由于经过剧烈条件提炼产生的潲水油所含的DNA成分的结构受到严重破坏，其数量本来已经极其稀少。如果潲水油再以较低的比例（如10%以下）掺入到食用植物油中，要采用通常的PCR扩增技术检测样品中的动物基因是难以实现的。
低丰度因子含量检测中，实时荧光定量PCR、杂交等方法都因受到背景DNA或杂质的干扰，使得检测灵敏度及精确性都达不到精细定量的要求（如定量PCR检测中Ct值大于33的情况下，其重复性就不是很高），而微滴式数字PCR通过微滴化处理，使得稀有的片段从大量的背景DNA中分离出来，从而提高了检测的灵敏度及精确性[5-7]。
1 材料与方法：
1.1 实验对象
原始潲水样本来自深圳市餐厨垃圾处理厂与本单位餐厅，共3份，编号为1-3。取回的潲水样本经初步过滤除渣、油水分离等处理后得到的潲水油与正常植物油按照不同浓度配比稀释，潲水油含量分别为100%，50%，20%，10%，5%，编号为潲水编号-潲水油含量百分比。其中正常植物油是某油脂公司提供的可溯源的大豆原油。
作为参比样品的市售植物油，为采购自深圳若干超市的大豆油、玉米油、花生油及食用调和油共20份。
1.2 仪器试剂
实时荧光定量PCR仪（ABI7500）；QX-100微滴式数字PCR仪（Bio-rad）；荧光PCR扩增试剂盒（TAKARA）； PCR扩增引物探针由上海生物工程有限公司合成，扩增片段名称及引物序列详见参考文献[3-4]。
1.3 检测方法
实时荧光定量PCR法[3]，QX-100微滴式数字PCR法[8]。
2 结果
2.1食用植物油的检测结果 食用植物油，包括采购自超市的20份样品以及某油脂公司提供的2份样品，采用实时荧光定量PCR法和QX-100微滴式数字PCR法两种检验方法，鸡特异性cytb基因、牛特异性cytb基因、羊特异性cytb基因、猪特异性线粒体基因和大米特异性GOS9基因的检测结果均为阴性。其中某油脂公司提供的大豆原油样品中的大豆特异性lectin基因检测结果为阳性。
2.2潲水油样本鸡特异性cytb基因检测结果
对经稀释的潲水油样本，利用预实验中灵敏度和检出率均较高的鸡特异性cytb基因进行检测。具体结果见表1。
2.3低含量潲水油样本多次重复检测结果
将低含量的潲水油样本1-5%，2-5%，3-5%进行多次重复检测。具体结果见表2-3。
3 讨论
表1的结果表明，在相同的稀释条件下，微滴式数字PCR的检出限明显低于实时荧光定量PCR。对于1-3号样本，实时荧光定量PCR的检出限分别为10%、20%、50%，而微滴式数字PCR的检出限分别为5%、10%、10%。
表2的结果表明，在多次重复检测的情况下，微滴式数字PCR可以检出低于正常检出限的样本，而实时荧光定量PCR无法做到。因为各自的判定原理不同：实时荧光定量PCR的阳性判定取决于Ct值，在样本浓度低的情况下，Ct值过大而且无法稳定检出，无法通过阳性判定标准；而微滴式数字PCR的判定为只要有阳性微滴即可判为检出，因此灵敏度更高。
以上数据表明，微滴式数字PCR检出限低于实时荧光定量PCR，且通过多次重复检测的方法可以进一步提高检出限。因此微滴式数字PCR方法比现行实时荧光定量PCR方法灵敏度有所提高，结果判定更准确，假阴性率降低。
微滴式数字PCR检测仪是在传统的定量PCR的基础上采用一种全新的方式对核酸分子进行定量；与传统的PCR、定量PCR相比，其核心技术就是在PCR扩增前对反应管中的20ul反应体系进行微滴化处理即将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个体积为1nl的液化微滴，其中每个微滴不含待检核酸靶分子，或含有一个至数个待检核酸靶分子，在同一个反应管中，这样所形成的每个油包水的微滴都可作为一个独立的PCR反应器，经微滴式扩增仪扩增后，利用微滴检测仪再逐个对每个微滴进行扫描检测，有荧光信号的微滴判读为”1”，没有荧光信号的微滴判读为”0”，最后根据泊松分布原理及阳性微滴的个数，分析软件即可给出靶分子的绝对起始拷贝数及浓度，从而可广泛的应用与科研及检测中对核酸的精确定量。
与传统定量PCR 不同，数字PCR 通过直接计数的方法，可以实现起始DNA 模板的绝对定量，因此特别适合用于Ct值不能很好分辨的应用领域，例如拷贝数变异、突变检测、等位基因失衡和单细胞基因表达等。对于这些低浓度样品，检测通量越高，可检测到样品信号的概率越大，灵敏度也就越高[9-10]。
参考文献：
[1] 杨冬燕，杨永存，杨小柯等.潲水油、掺假食用植物油鉴定方法研究进展[J].中国卫生检验杂志，2009，19（10）：2459-2460.
[2] 杨冬燕，楊小柯，杨永存等.精炼食用植物油PCR检测技术研究[J].中国卫生检验杂志，2010，20（4）：700-702.
[3] 杨冬燕，杨小柯，杨永存等.潲水油聚合酶链式反应鉴定技术研究[J].中国食品卫生杂志，2011，23（3）：63-68.
[4] 杨冬燕，杨永存，杨小柯等.物种特异性基因扩增鉴别掺假食用植物油[J].中国卫生检验杂志，2011，21（9）：2120-2122.
[5] 林彩琴，姚波.数字PCR 技术进展[J].化学进展，2012，24（12）：2415-2423.
[6] 李亮，隋志伟，王晶等.基于数字PCR的单分子DNA定量技术研究进展[J].生物化学与生物物理进展，2012，39（10）：1017-1023.
[7] Chiu RW，Cantor CR，Lo YM.Non-invasive prenatal diagnosis by single molecule counting technologies[J].Trends Genet，2009，25（7）：324-331.
[8] Benjamin JH，Kevin DN，Donald AM，et al.High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number[J].Anal Chem，2011，83（10）：8604-8610.
[9] 朱强远，杨文秀，高一博等.一种可绝对定量核酸的数字PCR微流控芯片[J].高等学校化学学报，2013，34（3）：545-550.
[10] Chen R，Mias GI，Li-Pook-Than J，et al.Personal omics profiling reveals dynamic molecular and medical phenotypes[J].Cell，2012，148（6）：1293-1307.
基金项目：
深圳市科技计划项目重点项目（201201008）；深圳市技术研究开发计划技术攻关项目（深发改【2012】866号）
【关键词】潲水油；微滴式数字PCR；动物源性基因；实时荧光定量PCR
【中图分类号】R-3 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）05-0022-02
Primary application study of droplet digital PCR in identifying hogwash oil
Li Hao， Yang Dong-Yan， Yang Yong-cun， Zhang Qian， Geng Yi-jie， Deng Ping-jian*
（Shenzhen Center for Disease Control and Prevention， Shenzhen 518055， China）
【Abstract】Objective：Establish the identification method for hogwash oil identification by droplet digital PCR （ddPCR） based on current real-time quantitative PCR （RT-qPCR） method， to improve the sensitivity. Methods：Hogwash oil samples from confirmed origins are mixed with normal edible plant oil by different proportions， and the mixed samples are tested by droplet digital PCR. Results：All samples can be identified by droplet digital PCR method except the extremely low concentration （with hogwash oil ≤10%）. Conclusion：Compared to the current RT-qPCR， the droplet digital PCR could improve the sensitivity and reduce the false negative rates to provide more accurate results.
【Key words】hogwash oil； ddPCR； animal-specific gene； RT-qPCR
近年來，全国不少地方发现了用餐厨废弃物提炼生产的潲水油（俗称地沟油），经非法渠道回流到餐桌，带来严重食品安全隐患，群众对此反映强烈，引起社会广泛关注[1]。本课题组自2008年以来开展研究以基因为标志物检测潲水油的方法。先后选用的标志物包括猪、牛、羊、鸡、米、麦、马铃薯、辣椒等动物和植物的基因片段。建立了油样中核酸的提取和富集方法和标志物的实时荧光定量PCR扩增检测方法[2-4]。该方法的特异性优于利用理化指标鉴定潲水油的方法。在适用性方面，动物基因作为标志物的最大优势在于它能适用于以各种原料、工艺和条件提炼生产的潲水油的检测。2011年9月至今，本课题组已接受本地公安部门和食安办送检的疑似潲水油样本95份，部分样本的标志物检测结果为强阳性。
动物基因标志物存在的问题是其检测敏感度不足。虽然，基于基因片段的PCR技术是目前对生物内源性成分检测敏感性最高的技术，可实现对超微量的靶基因的指数扩增和检测。但由于经过剧烈条件提炼产生的潲水油所含的DNA成分的结构受到严重破坏，其数量本来已经极其稀少。如果潲水油再以较低的比例（如10%以下）掺入到食用植物油中，要采用通常的PCR扩增技术检测样品中的动物基因是难以实现的。
低丰度因子含量检测中，实时荧光定量PCR、杂交等方法都因受到背景DNA或杂质的干扰，使得检测灵敏度及精确性都达不到精细定量的要求（如定量PCR检测中Ct值大于33的情况下，其重复性就不是很高），而微滴式数字PCR通过微滴化处理，使得稀有的片段从大量的背景DNA中分离出来，从而提高了检测的灵敏度及精确性[5-7]。
1 材料与方法：
1.1 实验对象
原始潲水样本来自深圳市餐厨垃圾处理厂与本单位餐厅，共3份，编号为1-3。取回的潲水样本经初步过滤除渣、油水分离等处理后得到的潲水油与正常植物油按照不同浓度配比稀释，潲水油含量分别为100%，50%，20%，10%，5%，编号为潲水编号-潲水油含量百分比。其中正常植物油是某油脂公司提供的可溯源的大豆原油。
作为参比样品的市售植物油，为采购自深圳若干超市的大豆油、玉米油、花生油及食用调和油共20份。
1.2 仪器试剂
实时荧光定量PCR仪（ABI7500）；QX-100微滴式数字PCR仪（Bio-rad）；荧光PCR扩增试剂盒（TAKARA）； PCR扩增引物探针由上海生物工程有限公司合成，扩增片段名称及引物序列详见参考文献[3-4]。
1.3 检测方法
实时荧光定量PCR法[3]，QX-100微滴式数字PCR法[8]。
2 结果
2.1食用植物油的检测结果 食用植物油，包括采购自超市的20份样品以及某油脂公司提供的2份样品，采用实时荧光定量PCR法和QX-100微滴式数字PCR法两种检验方法，鸡特异性cytb基因、牛特异性cytb基因、羊特异性cytb基因、猪特异性线粒体基因和大米特异性GOS9基因的检测结果均为阴性。其中某油脂公司提供的大豆原油样品中的大豆特异性lectin基因检测结果为阳性。
2.2潲水油样本鸡特异性cytb基因检测结果
对经稀释的潲水油样本，利用预实验中灵敏度和检出率均较高的鸡特异性cytb基因进行检测。具体结果见表1。
2.3低含量潲水油样本多次重复检测结果
将低含量的潲水油样本1-5%，2-5%，3-5%进行多次重复检测。具体结果见表2-3。
3 讨论
表1的结果表明，在相同的稀释条件下，微滴式数字PCR的检出限明显低于实时荧光定量PCR。对于1-3号样本，实时荧光定量PCR的检出限分别为10%、20%、50%，而微滴式数字PCR的检出限分别为5%、10%、10%。
表2的结果表明，在多次重复检测的情况下，微滴式数字PCR可以检出低于正常检出限的样本，而实时荧光定量PCR无法做到。因为各自的判定原理不同：实时荧光定量PCR的阳性判定取决于Ct值，在样本浓度低的情况下，Ct值过大而且无法稳定检出，无法通过阳性判定标准；而微滴式数字PCR的判定为只要有阳性微滴即可判为检出，因此灵敏度更高。
以上数据表明，微滴式数字PCR检出限低于实时荧光定量PCR，且通过多次重复检测的方法可以进一步提高检出限。因此微滴式数字PCR方法比现行实时荧光定量PCR方法灵敏度有所提高，结果判定更准确，假阴性率降低。
微滴式数字PCR检测仪是在传统的定量PCR的基础上采用一种全新的方式对核酸分子进行定量；与传统的PCR、定量PCR相比，其核心技术就是在PCR扩增前对反应管中的20ul反应体系进行微滴化处理即将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个体积为1nl的液化微滴，其中每个微滴不含待检核酸靶分子，或含有一个至数个待检核酸靶分子，在同一个反应管中，这样所形成的每个油包水的微滴都可作为一个独立的PCR反应器，经微滴式扩增仪扩增后，利用微滴检测仪再逐个对每个微滴进行扫描检测，有荧光信号的微滴判读为”1”，没有荧光信号的微滴判读为”0”，最后根据泊松分布原理及阳性微滴的个数，分析软件即可给出靶分子的绝对起始拷贝数及浓度，从而可广泛的应用与科研及检测中对核酸的精确定量。
与传统定量PCR 不同，数字PCR 通过直接计数的方法，可以实现起始DNA 模板的绝对定量，因此特别适合用于Ct值不能很好分辨的应用领域，例如拷贝数变异、突变检测、等位基因失衡和单细胞基因表达等。对于这些低浓度样品，检测通量越高，可检测到样品信号的概率越大，灵敏度也就越高[9-10]。
参考文献：
[1] 杨冬燕，杨永存，杨小柯等.潲水油、掺假食用植物油鉴定方法研究进展[J].中国卫生检验杂志，2009，19（10）：2459-2460.
[2] 杨冬燕，楊小柯，杨永存等.精炼食用植物油PCR检测技术研究[J].中国卫生检验杂志，2010，20（4）：700-702.
[3] 杨冬燕，杨小柯，杨永存等.潲水油聚合酶链式反应鉴定技术研究[J].中国食品卫生杂志，2011，23（3）：63-68.
[4] 杨冬燕，杨永存，杨小柯等.物种特异性基因扩增鉴别掺假食用植物油[J].中国卫生检验杂志，2011，21（9）：2120-2122.
[5] 林彩琴，姚波.数字PCR 技术进展[J].化学进展，2012，24（12）：2415-2423.
[6] 李亮，隋志伟，王晶等.基于数字PCR的单分子DNA定量技术研究进展[J].生物化学与生物物理进展，2012，39（10）：1017-1023.
[7] Chiu RW，Cantor CR，Lo YM.Non-invasive prenatal diagnosis by single molecule counting technologies[J].Trends Genet，2009，25（7）：324-331.
[8] Benjamin JH，Kevin DN，Donald AM，et al.High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number[J].Anal Chem，2011，83（10）：8604-8610.
[9] 朱强远，杨文秀，高一博等.一种可绝对定量核酸的数字PCR微流控芯片[J].高等学校化学学报，2013，34（3）：545-550.
[10] Chen R，Mias GI，Li-Pook-Than J，et al.Personal omics profiling reveals dynamic molecular and medical phenotypes[J].Cell，2012，148（6）：1293-1307.
基金项目：
深圳市科技计划项目重点项目（201201008）；深圳市技术研究开发计划技术攻关项目（深发改【2012】866号）