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摘要 目的：觀察蜂毒素对博莱霉素诱导小鼠肺纤维化的干预作用。方法：70只SPF级C57BL/6小鼠被随机分为正常组10只和模型组、地塞米松组、蜂毒素低剂量组、蜂毒素中剂量组、蜂毒素高剂量组各12只。除正常组外，均采用气管穿刺注入博莱霉素（BLM）制备肺纤维化小鼠模型。从术后第1天开始，地塞米松组按3 mg/kg的剂量腹腔注射，蜂毒素低、中、高剂量组分别给予5 μg/（kg·d）、10 μg/（kg·d）、20 μg/（kg·d），对照组和模型组给予等体积生理盐水灌胃，连续2周。分别于第7、第14天处死动物，收集小鼠外周血样本，通过ELISA方法检测血清转化生长因子（TGF-β1）、胶原蛋白I（CollagenI）、胶原蛋白III（CollagenIII）、基质金属蛋白酶2（MMP2）和基质金属蛋白酶9（MMP9）的水平。取肺组织进行苏木精-伊红（HE）分析，Masson染色和羟脯氨酸（HYP）评估以观察组织病理学变化和胶原沉积。采用实时荧光定量（Real-ime PCR）法和蛋白兔疫印迹法（Western blot）观察各组大鼠肺组织TGF-β1、Smad2、Smad3等蛋白和基因的表达变化。结果：与对照组比较，模型组大鼠肺纤维化明显，HYP、TGF-β1、CollagenI、CollagenI的含量升高（P<0.05），肺组织TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白和基因表达升高（P<0.05）;与模型组比较，蜂毒素中高剂量组血清HYP、TGF-β1、CollagenI、CollagenI的含量下降（P<0.05），肺组织TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白和基因表达降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：蜂毒素可以减轻博来霉素诱导的小鼠肺纤维化的程度，其机制可能与抑制TGF-β1/Smads通路有关。
关键词 蜂毒素;抑制;博莱霉素;小鼠;肺纤维化;机制;TGF-β1/Smads通路;羟脯氨酸
Study on the Mechanism of Melittin Inhibiting Pulmonary Fibrosis Induced by Bleomycin in Rats
Li Li，Wei Lei，Wang Zhongfu，Zhang Xiulian，Qian Yechang
（1 Baoshan Branch，Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201900，China）
Abstract Objective：To observe the effects of melittin on inhibiting pulmonary fibrosis induced by bleomycin in rats. Methods：Seventy SPF grade C57BL/6 rats were randomly divided into the normal group（n=10）and the model group，dexamethasone group and melittin low dose group，melittin middle dose group and melittin high dose group（n=12）. In addition to the normal group，a rat model of pulmonary fibrosis was prepared by injecting bleomycin（BLM）into the trachea. From the first day after surgery，the dexamethasone group was intraperitoneally injected at a dose of 3 mg/kg，while the low，medium and high doses of melittin were administered to 5，10，and 20 μg/（kg·d） respectively. The control group and the model group were given an equal volume of saline for 2 weeks. The animals were sacrificed on the 7th and 14th day，respectively，peripheral blood samples of which were collected. ELISA was used to detect serum transforming growth factor（TGF-β1），collagen I（Collagen I），collagen III（Collagen III），and matrix metalloproteinase 2（MMP2）and the level of matrix metalloproteinase 9（MMP9）. Lung tissue was taken for hematoxylin-eosin（HE）analysis，Masson staining and hydroxyproline（HYP）evaluation to observe histopathological changes and collagen deposition. The expressions of TGF-β1，Smad2，Smad3 and other proteins and genes in lung tissue of each group were observed by Real-time PCR and Western blot. Results：Compared with the control group，the pulmonary fibrosis was significantly increased in the model group. The contents of HYP，TGF-β1，Collagen I and Collagen I were increased（P<0.05），and the expression of TGF-β1，Smad2，Smad3 protein and gene in lung tissue was increased（P<0.05）; Compared with the model group，the levels of serum HYP，TGF-β1，Collagen I，CollagenI in the high dose group of melittin decreased（P<0.05），and TGF-β1，Smad2，Smad3 protein in lung tissue and gene expression was decreased（P<0.05）. There was no statistically significant difference in the low-dose group. Conclusion：Melittin can effectively reduce the degeneration of pulmonary fibrosis induced by bleomycin，and its mechanism may be related to the regulation of TGF-β1/Smads pathway. Key Words Melittin; Inhibition; Bleomycin; Pulmonary fibrosis; Mechanism; TGF-β1/Smads pathway; Hydroxyproline
中图分类号：R563;R256文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.03.018
肺纤维化（Pulmonary Fibrosis，PF）是一种进行性加重的肺间质疾病，以限制性通气功能障碍、进行性弥漫性肺间质纤维化为特征，最终可导致呼吸衰竭，预后极差[1]。目前治疗手段有限[2-3]。在参与肺损伤纤维化的细胞因子网络中，转化生长因子（Transforming Growth Factor-，TGF-β1）是最重要的细胞因子[4-6]，也是PF发生中重要的刺激信号[7]。TGF-β1可使肺成纤维细胞发生过度增殖和分化[8]，也是目前已知最强的细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM）沉积促进剂[9]。TGF-β/Smads是研究PF最多的一条通路，通过Smad3信号过度表达引起纤维増生性疾病和纤维化[10]，而PF的形成与Smad2、Smad3蛋白表达有紧密联系[11]。间质型胶原（collagenⅠ型、Ⅲ型）在肺内广泛分布，在PE的形成过程中也占有重要地位[12]。基质金属蛋白（Matrixmetallo Proteinases，MMPS）属于蛋白酶家族，是降解细胞外基质最重要的家族，研究发现MMP2和MMP9可参与TGF-β1的激活，TGF-β1也可调节MMPS、TIMPS的表达[13]。
中医学对PF并无特定病名，但根据其致病因素、临床表现，多归属于“肺痿”“肺痹”等病证范畴。本病责之肺肾气虚，邪气入中，久留肺络，气血因瘀而滞，肺络因痹而痿，故气虚血瘀是PF的主要病机，益气活血法是治其之基本大法。蜂毒是工蜂毒腺分泌的一种成分复杂的化合物，主要成分包括蜂毒肽、蜂毒明肽、肥大细胞脱粒肽、磷脂酶A2、透明质酸酶等多种活性物质，均具有广泛的药理学作用。蜂毒肽（melittin）是蜂毒中的主要功能物质，是由26个氨基酸残基组成的多肽，约占蜂毒干重的50%，可以抗血小板聚集，延长小鼠体外凝血时间，有很强的抗凝作用，因而具有活血化瘀之显著功效[14]。同时作为一种细胞毒类的药物，因其分子小、稳定性高，而具有消炎镇痛、改善微循环、免疫调节以及促进肾上腺皮质激素分泌等多种功效[15]。本研究通过博莱霉素构造小鼠PF模型，分别予以蜂毒素及地塞米松进行干预，旨在观察蜂毒素对PF的影響及其作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 4～5周龄的健康SPF级C57BL/6雌性小鼠共72只，每只体质量20 g左右，购买于上海西普尔—必凯实验动物有限公司，实验动物质量合格证号：20130016005315，许可证号：SCXK（沪）2013-0016。实验时间：2017年7月至2018年12月，实验动物饲养条件为：温度21～24 ℃，湿度约为50%，光照与否循环时间为12 h，灭菌饲料和饮用水由动物中心统一提供并由饲养者自行取用。
1.1.2 药物 博莱霉素（日本，日本化药株式会社，生产批号：H20055883）;蜂毒素（阿拉丁生物公司，生产批号：Lot#：H1801124）。
1.1.3 试剂与仪器 RNA试剂盒（日本，Takara bio inc公司，批号：RR420A）、HYP试剂盒（美国，Sigma-Aldrich公司，批号：MAK008-1KT）;兔抗GAPDH多克隆抗体（美国，Cell Signaling Technology公司，批号：5174S），兔抗TGF-β1单克隆抗体（美国，Cell Signaling Technology公司，批号：3711S）;兔抗Smad2多克隆抗体（美国，Cell Signaling Technology公司，批号：8685S），兔抗Smad3单克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司，批号：bsm-52224R），兔抗p-Smad2多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司，批号：bs-2224R），兔抗p-Smad3多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司，批号：bs-3425R）。PCR扩增仪（美国，伯乐，批号：MSMZ120004）;酶标（美国，宝特，批号：EXL-808）;低温离心机（德国，艾本德，批号：SIGMA 3-30KS）;凝胶数码成像系统（上海天能，批号：Tanon 4100）。
1.2 方法
1.2.1 分组与模型制备 小鼠适应环境7 d后，随机分为6组：正常组（NS）10只;模型组、地塞米松组、蜂毒素低剂量组、蜂毒素中剂量组、蜂毒素高剂量组各12只，每组分别在术后第7天、第14天进行检测。每个时间点6只。除NS组外，余各组以1.5%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后固定，将小鼠仰卧固定于实验台，固定头和四肢，常规消毒，沿颈部正中线作一切口，钝性分离各层组织，暴露气管，经气管软骨环间隙向气管内缓慢注入博莱霉素生理盐水溶液（5 mg/kg）0.2～0.3 mL，注射后迅速将小鼠直立并旋转，使药液在肺内均匀分布[16]。将动物置于干燥、温暖条件下喂养，定期对喂养场所消毒。
1.2.2 给药方法 模型建立24 h后腹腔注射干预药物，1次/d，依据小鼠与人药物剂量折算方法[17]，计算蜂毒素低、中、高剂量组分别给予5 μg/kg、10 μg/kg、20 μg/kg，地塞米松组为地塞米松3 mg/kg，模型组和假手术（NS）组在相同条件下向气管内注入等容量生理盐水;蜂毒素处理组分别腹腔注射5 μg/（kg·d）、10 μg/（kg·d）、20 μg/（kg·d）的蜂毒素干预处理;地塞米松处理组腹腔注射3 mg/（kg·d）的地塞米松。 1.2.3 检测指标与方法
1.2.3.1 在第14天，收集所有小鼠的肺组织4%多聚甲醛内固定12 h，梯度乙醇脱水，包埋切片，采用苏木精伊红染色法（HE）光镜下观察肺组织病理形态改变。此外，进行Masson三色染色以测量胶原纤维的密度。通过炎性细胞的浸润，肺泡壁的厚度以及胶原沉积的严重程度来评估PF的程度。
1.2.3.2 羟脯氨酸（Hydroxyproline，HYP）含量测定 右肺组织液氮保存，取肺组织匀浆进行羟脯氨酸含量测定，以检测肺组织胶原沉积情况，操作严格按照说明书进行。
1.2.3.3 ELISA检测TGF-β1、CollagenⅠ/Ⅲ、MMP2/9含量 留取小鼠血清，采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）测定TGF-β1、CollagenⅠ/Ⅲ、MMP2/9，抗小鼠TGF-β1、CollagenⅠ/Ⅲ、MMP2/9单克隆抗体（单抗）包被于酶标板上，标准品及肺组织中的TGF-β1、CollagenⅠ/Ⅲ、MMP2/9与其单抗结合，室温孵育2 h后洗涤5次，洗去未结合物;加入辣根过氧化物酶标记的抗小鼠TGF-β1、CollagenⅠ/Ⅲ、MMP2/9，与结合在单抗上的TGF-β1、CollagenⅠ/Ⅲ、MMP2/9形成免疫复合物，室温孵育2 h后洗涤5次;加入显色剂，室温避光30 min，若反应孔中有上述细胞因子存在（呈蓝色），则加入反应终止液后变为黄色。在波长450 nm处测定吸光度（A）值，通过绘制标准曲线求出肺组织中TGF-β1、CollagenⅠ/Ⅲ、MMP2/9的浓度。
1.2.3.4 实时荧光定量（Real-time PCR）法检测TGF-β1、Smad2/3 mRNA的表达 按照以下[18]的方法提取肺组织总RNA，用匀浆机把肺组织研成悬液，加入0.2 mL氯仿，离心12 000 r/min，4 ℃，15 min，取上清，再加入异丙醇，混匀、离心，弃上清，用无水乙醇清洗，再加入DEPC水测RNA浓度（ng/μL），再进行反转录，按照说明书进行PCR。
1.2.3.5 蛋白免疫印迹法（Western blot）检测肺组织中TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表达情况 取大约500 mg肺组织，加1 mL RIPA裂解液使其组织充分裂解。充分裂解组织后，4 ℃ 12 000 r/min离心5 min，取上清液体，测蛋白浓度测定，根据测得的各样品蛋白浓度，从不同样品中分别取40 μg蛋白，用PBS补足体积至20 μL，再加入4 μL的5×上样缓冲液，混匀，离心4 ℃，12 000 r/min，30 s，100 ℃水浴锅变性10 min，冷卻，4 ℃ 12 000 r/min离心30 s。进行电泳、转膜，再进行封闭，加入足量的封闭液（5%BSA溶液：1 g BSA：20 mL PBST）封闭，室温缓慢平摇1～2 h。孵育一抗（1∶250），缓慢平摇孵育，4 ℃过夜。次日以1×PBST液漂洗，再加入HRP标记的二抗（1∶5 000），室温振摇1 h1×PBST液漂洗，DAB显色，然后用蒸馏水洗膜。每组取5个样本纳入统计。
1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0统计软件对研究数据进行统计分析，实验数据用均数+标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 蜂毒素能有效减轻BLM诱导的小鼠肺组织病理学变化 通过HE和Masson染色分析小鼠肺组织病理学改变。模型组小鼠第7天表现为肺泡间隔增宽，肺泡腔、肺间质内有大量的多核及单核细胞浸润，第14天时肺泡炎性反应较前有所减轻，但成纤维细胞增生明显，胶原蛋白沉积在新生的毛细血管周围，肺泡间隔增宽，肺泡结构萎陷，肺泡腔被胶原蛋白及成纤维细胞填充。蜂毒低剂量组干预后与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。单纯的地塞米松组和蜂毒素中剂量组分别干预后，肺泡炎性反应和胶原蛋白沉积程度均较同一时间点的模型组有所减轻。而蜂毒素高剂量组能够明显减轻BLM诱导的小鼠肺组织纤维化程度。见图1、2。
2.2 蜂毒素组可有效减少胶原沉积和羟脯氨酸含量 单纯地塞米松组和蜂毒中剂量组分别干预后，第14天测定肺组织羟脯氨酸含量有所降低，这与Masson染色结果相对应。蜂毒高剂量组HYP含量在第14天降低更为明显，基本达到与正常对照组相接近的水平。见图3。
2.3 蜂毒素可有效降低纤维发生相关细胞因子的水平 在第7天、第14天用ELISA评估小鼠血清中TGF-β1、Collagen I/Ⅲ和MMP2/9的含量。我们发现模型组各时间点TGF-β1、Collagen I/Ⅲ和MMP2/9的含量明显升高。蜂毒低剂量组与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05），而地塞米松组、蜂毒中、高剂量组同一时间点各细胞因子含量均明显降低。见图4。
2.4 蜂毒素对肺组织中TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表达的影响 与对照组比较，模型组小鼠TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA在第14天时表达显著升高（P<0.01）;蜂毒素低剂量组与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）;与模型组比较蜂毒素中剂量组Smad3 mRNA表达降低（P<0.01），蜂毒素高剂量组TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表达明显降低（P<0.001），地塞米松组TGF-β1、Smad3 mRNA表达均明显降低（P<0.05）。见图5。
2.5 蜂毒素对肺组织中TGF-β1、Smad2/3、P-Smad2/3蛋白表达的影响 在第7天、第14天与对照组比较，模型组小鼠TGF-β1、Smad2/3、P-Smad2/3蛋白表达显著升高（P<0.01）;蜂毒素低剂量组与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05），蜂毒素中剂量组P-Smad2/3蛋白表达降低（P<0.01），蜂毒素高剂量组TGF-β1、P-Smad2/3蛋白表达明显降低（P<0.001）;地塞米松组TGF-β1、P-Smad2/3蛋白表达均明显降低（P<0.05）。见图6。 3 討论
PF的病理变化包括细胞外基质过度沉积、间质慢性炎性反应、成纤维细胞增殖和肺泡结构塌陷等[19-20]。国内外研究表明，细胞因子在纤维化疾病中扮演了至关重要的角色，特别是TGF-β1作为关键的上游致纤维化因子，具有多种生物学功能，能使成纤维细胞活化，胶原合成增加、ECM过度沉积而致纤维化[21-22]。Smads蛋白作为TGF-β家族的特异性细胞内信号转导分子，可以激活TGF-β，使Smad2和Smad3磷酸化[23]，其表达与PF的形成直接相关[24]。Sriram[25]等研究博来霉素诱导PF大鼠模型中发现，TGF-β1和Smad3在PF大鼠体内显著表达，ECM沉积明显，给药后TGF-β1、Smad3以及胶原表达均显著降低。积聚在肺间质中的胶原，主要以Ⅰ型和Ⅲ型胶原为主[26]。纤维细胞分泌几种MMP，包括MMP-2，MMP-7，MMP-8和MMP-9[27]。MMP-9和MMP-2它们的主要结构和底物具有特异性[28]。最近研究发现[29]MMPS具有多种生物学功能，其中MMP-2和MMP-9的抑制显着减弱了纤维细胞迁移和沉积。因此抑制胶原的合成与沉积，可以有效减轻PF。
纤维化可发生于各部位及多器官，引起组织器官内纤维结缔组织（硬结）增多，而研究[30]蜂针能消除纤维化结节。咖啡酸苯乙酯（Caffeic Acid Phenethyl Ester，CAPE）是一种天然的黄酮类化合物，是蜂胶中的主要成分。CAPE具有抗氧化、抗炎、抗癌，抗病毒和免疫调节的特性，已应用于多种疾病模型。刘瑞等[31]研究蜂胶提取物CAPE对大鼠PF的干预作用，结果显示肺组织纤维化程度，与BLM组比较，地塞米松（DEX）与CAPE联合观察组PF程度最弱，并且羟脯氨酸含量明显减低。辛绍杰[32]等观察蜂毒对144只大鼠实验性肝纤维化的疗效，结果表明观察组在肝纤维化完全形成后再给药，治疗3个月后发现，Ⅰ-Ⅲ级纤维化分别占54.5%和66.7%，明显轻于模型组。PARK等[33]研究结果显示蜂毒肽对于抑制肝脏炎性反应和纤维化有一定的效果，并且进一步[34]证明蜂毒肽是通过使cspase和基因蛋白bax的表达降低，以及体内细胞色素C的释放，使肝脏不受到损害。
我国拥有非常丰富的蜂毒资源，但对于蜂毒药理以及临床应用的研究、开发和利用目前还不够深入，故针对该方面的研究具有广阔的前景。本研究结果显示，小鼠在给予一次性气管穿刺注入博莱霉素后，运用蜂毒素进行干预，经过7 d和14 d，通过HE和Masson染色所见肺组织纤维化及胶原沉积程度明显较模型组减轻，且羟脯氨酸（HYP）含量亦有明显降低，且与地塞米松组无明显差异，说明蜂毒素可以有效抑制BLM诱导的小鼠肺组织纤维化程度。通过地塞米松组或蜂毒素中、高剂量单独干预后发现血清中TGF-β1、Collagen I/Ⅲ和MMP2/9含量均有明显减少，同时小鼠肺组织中的TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA的表达较模型组显著降低，说明蜂毒素可从基因和蛋白水平上减轻PF，其作用机制可能与抑制TGF-β/Smads信号传导通路有关。
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关键词 蜂毒素;抑制;博莱霉素;小鼠;肺纤维化;机制;TGF-β1/Smads通路;羟脯氨酸
Study on the Mechanism of Melittin Inhibiting Pulmonary Fibrosis Induced by Bleomycin in Rats
Li Li，Wei Lei，Wang Zhongfu，Zhang Xiulian，Qian Yechang
（1 Baoshan Branch，Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201900，China）
Abstract Objective：To observe the effects of melittin on inhibiting pulmonary fibrosis induced by bleomycin in rats. Methods：Seventy SPF grade C57BL/6 rats were randomly divided into the normal group（n=10）and the model group，dexamethasone group and melittin low dose group，melittin middle dose group and melittin high dose group（n=12）. In addition to the normal group，a rat model of pulmonary fibrosis was prepared by injecting bleomycin（BLM）into the trachea. From the first day after surgery，the dexamethasone group was intraperitoneally injected at a dose of 3 mg/kg，while the low，medium and high doses of melittin were administered to 5，10，and 20 μg/（kg·d） respectively. The control group and the model group were given an equal volume of saline for 2 weeks. The animals were sacrificed on the 7th and 14th day，respectively，peripheral blood samples of which were collected. ELISA was used to detect serum transforming growth factor（TGF-β1），collagen I（Collagen I），collagen III（Collagen III），and matrix metalloproteinase 2（MMP2）and the level of matrix metalloproteinase 9（MMP9）. Lung tissue was taken for hematoxylin-eosin（HE）analysis，Masson staining and hydroxyproline（HYP）evaluation to observe histopathological changes and collagen deposition. The expressions of TGF-β1，Smad2，Smad3 and other proteins and genes in lung tissue of each group were observed by Real-time PCR and Western blot. Results：Compared with the control group，the pulmonary fibrosis was significantly increased in the model group. The contents of HYP，TGF-β1，Collagen I and Collagen I were increased（P<0.05），and the expression of TGF-β1，Smad2，Smad3 protein and gene in lung tissue was increased（P<0.05）; Compared with the model group，the levels of serum HYP，TGF-β1，Collagen I，CollagenI in the high dose group of melittin decreased（P<0.05），and TGF-β1，Smad2，Smad3 protein in lung tissue and gene expression was decreased（P<0.05）. There was no statistically significant difference in the low-dose group. Conclusion：Melittin can effectively reduce the degeneration of pulmonary fibrosis induced by bleomycin，and its mechanism may be related to the regulation of TGF-β1/Smads pathway. Key Words Melittin; Inhibition; Bleomycin; Pulmonary fibrosis; Mechanism; TGF-β1/Smads pathway; Hydroxyproline
中图分类号：R563;R256文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.03.018
肺纤维化（Pulmonary Fibrosis，PF）是一种进行性加重的肺间质疾病，以限制性通气功能障碍、进行性弥漫性肺间质纤维化为特征，最终可导致呼吸衰竭，预后极差[1]。目前治疗手段有限[2-3]。在参与肺损伤纤维化的细胞因子网络中，转化生长因子（Transforming Growth Factor-，TGF-β1）是最重要的细胞因子[4-6]，也是PF发生中重要的刺激信号[7]。TGF-β1可使肺成纤维细胞发生过度增殖和分化[8]，也是目前已知最强的细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM）沉积促进剂[9]。TGF-β/Smads是研究PF最多的一条通路，通过Smad3信号过度表达引起纤维増生性疾病和纤维化[10]，而PF的形成与Smad2、Smad3蛋白表达有紧密联系[11]。间质型胶原（collagenⅠ型、Ⅲ型）在肺内广泛分布，在PE的形成过程中也占有重要地位[12]。基质金属蛋白（Matrixmetallo Proteinases，MMPS）属于蛋白酶家族，是降解细胞外基质最重要的家族，研究发现MMP2和MMP9可参与TGF-β1的激活，TGF-β1也可调节MMPS、TIMPS的表达[13]。
中医学对PF并无特定病名，但根据其致病因素、临床表现，多归属于“肺痿”“肺痹”等病证范畴。本病责之肺肾气虚，邪气入中，久留肺络，气血因瘀而滞，肺络因痹而痿，故气虚血瘀是PF的主要病机，益气活血法是治其之基本大法。蜂毒是工蜂毒腺分泌的一种成分复杂的化合物，主要成分包括蜂毒肽、蜂毒明肽、肥大细胞脱粒肽、磷脂酶A2、透明质酸酶等多种活性物质，均具有广泛的药理学作用。蜂毒肽（melittin）是蜂毒中的主要功能物质，是由26个氨基酸残基组成的多肽，约占蜂毒干重的50%，可以抗血小板聚集，延长小鼠体外凝血时间，有很强的抗凝作用，因而具有活血化瘀之显著功效[14]。同时作为一种细胞毒类的药物，因其分子小、稳定性高，而具有消炎镇痛、改善微循环、免疫调节以及促进肾上腺皮质激素分泌等多种功效[15]。本研究通过博莱霉素构造小鼠PF模型，分别予以蜂毒素及地塞米松进行干预，旨在观察蜂毒素对PF的影響及其作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 4～5周龄的健康SPF级C57BL/6雌性小鼠共72只，每只体质量20 g左右，购买于上海西普尔—必凯实验动物有限公司，实验动物质量合格证号：20130016005315，许可证号：SCXK（沪）2013-0016。实验时间：2017年7月至2018年12月，实验动物饲养条件为：温度21～24 ℃，湿度约为50%，光照与否循环时间为12 h，灭菌饲料和饮用水由动物中心统一提供并由饲养者自行取用。
1.1.2 药物 博莱霉素（日本，日本化药株式会社，生产批号：H20055883）;蜂毒素（阿拉丁生物公司，生产批号：Lot#：H1801124）。
1.1.3 试剂与仪器 RNA试剂盒（日本，Takara bio inc公司，批号：RR420A）、HYP试剂盒（美国，Sigma-Aldrich公司，批号：MAK008-1KT）;兔抗GAPDH多克隆抗体（美国，Cell Signaling Technology公司，批号：5174S），兔抗TGF-β1单克隆抗体（美国，Cell Signaling Technology公司，批号：3711S）;兔抗Smad2多克隆抗体（美国，Cell Signaling Technology公司，批号：8685S），兔抗Smad3单克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司，批号：bsm-52224R），兔抗p-Smad2多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司，批号：bs-2224R），兔抗p-Smad3多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司，批号：bs-3425R）。PCR扩增仪（美国，伯乐，批号：MSMZ120004）;酶标（美国，宝特，批号：EXL-808）;低温离心机（德国，艾本德，批号：SIGMA 3-30KS）;凝胶数码成像系统（上海天能，批号：Tanon 4100）。
1.2 方法
1.2.1 分组与模型制备 小鼠适应环境7 d后，随机分为6组：正常组（NS）10只;模型组、地塞米松组、蜂毒素低剂量组、蜂毒素中剂量组、蜂毒素高剂量组各12只，每组分别在术后第7天、第14天进行检测。每个时间点6只。除NS组外，余各组以1.5%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后固定，将小鼠仰卧固定于实验台，固定头和四肢，常规消毒，沿颈部正中线作一切口，钝性分离各层组织，暴露气管，经气管软骨环间隙向气管内缓慢注入博莱霉素生理盐水溶液（5 mg/kg）0.2～0.3 mL，注射后迅速将小鼠直立并旋转，使药液在肺内均匀分布[16]。将动物置于干燥、温暖条件下喂养，定期对喂养场所消毒。
1.2.2 给药方法 模型建立24 h后腹腔注射干预药物，1次/d，依据小鼠与人药物剂量折算方法[17]，计算蜂毒素低、中、高剂量组分别给予5 μg/kg、10 μg/kg、20 μg/kg，地塞米松组为地塞米松3 mg/kg，模型组和假手术（NS）组在相同条件下向气管内注入等容量生理盐水;蜂毒素处理组分别腹腔注射5 μg/（kg·d）、10 μg/（kg·d）、20 μg/（kg·d）的蜂毒素干预处理;地塞米松处理组腹腔注射3 mg/（kg·d）的地塞米松。 1.2.3 检测指标与方法
1.2.3.1 在第14天，收集所有小鼠的肺组织4%多聚甲醛内固定12 h，梯度乙醇脱水，包埋切片，采用苏木精伊红染色法（HE）光镜下观察肺组织病理形态改变。此外，进行Masson三色染色以测量胶原纤维的密度。通过炎性细胞的浸润，肺泡壁的厚度以及胶原沉积的严重程度来评估PF的程度。
1.2.3.2 羟脯氨酸（Hydroxyproline，HYP）含量测定 右肺组织液氮保存，取肺组织匀浆进行羟脯氨酸含量测定，以检测肺组织胶原沉积情况，操作严格按照说明书进行。
1.2.3.3 ELISA检测TGF-β1、CollagenⅠ/Ⅲ、MMP2/9含量 留取小鼠血清，采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）测定TGF-β1、CollagenⅠ/Ⅲ、MMP2/9，抗小鼠TGF-β1、CollagenⅠ/Ⅲ、MMP2/9单克隆抗体（单抗）包被于酶标板上，标准品及肺组织中的TGF-β1、CollagenⅠ/Ⅲ、MMP2/9与其单抗结合，室温孵育2 h后洗涤5次，洗去未结合物;加入辣根过氧化物酶标记的抗小鼠TGF-β1、CollagenⅠ/Ⅲ、MMP2/9，与结合在单抗上的TGF-β1、CollagenⅠ/Ⅲ、MMP2/9形成免疫复合物，室温孵育2 h后洗涤5次;加入显色剂，室温避光30 min，若反应孔中有上述细胞因子存在（呈蓝色），则加入反应终止液后变为黄色。在波长450 nm处测定吸光度（A）值，通过绘制标准曲线求出肺组织中TGF-β1、CollagenⅠ/Ⅲ、MMP2/9的浓度。
1.2.3.4 实时荧光定量（Real-time PCR）法检测TGF-β1、Smad2/3 mRNA的表达 按照以下[18]的方法提取肺组织总RNA，用匀浆机把肺组织研成悬液，加入0.2 mL氯仿，离心12 000 r/min，4 ℃，15 min，取上清，再加入异丙醇，混匀、离心，弃上清，用无水乙醇清洗，再加入DEPC水测RNA浓度（ng/μL），再进行反转录，按照说明书进行PCR。
1.2.3.5 蛋白免疫印迹法（Western blot）检测肺组织中TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表达情况 取大约500 mg肺组织，加1 mL RIPA裂解液使其组织充分裂解。充分裂解组织后，4 ℃ 12 000 r/min离心5 min，取上清液体，测蛋白浓度测定，根据测得的各样品蛋白浓度，从不同样品中分别取40 μg蛋白，用PBS补足体积至20 μL，再加入4 μL的5×上样缓冲液，混匀，离心4 ℃，12 000 r/min，30 s，100 ℃水浴锅变性10 min，冷卻，4 ℃ 12 000 r/min离心30 s。进行电泳、转膜，再进行封闭，加入足量的封闭液（5%BSA溶液：1 g BSA：20 mL PBST）封闭，室温缓慢平摇1～2 h。孵育一抗（1∶250），缓慢平摇孵育，4 ℃过夜。次日以1×PBST液漂洗，再加入HRP标记的二抗（1∶5 000），室温振摇1 h1×PBST液漂洗，DAB显色，然后用蒸馏水洗膜。每组取5个样本纳入统计。
1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0统计软件对研究数据进行统计分析，实验数据用均数+标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 蜂毒素能有效减轻BLM诱导的小鼠肺组织病理学变化 通过HE和Masson染色分析小鼠肺组织病理学改变。模型组小鼠第7天表现为肺泡间隔增宽，肺泡腔、肺间质内有大量的多核及单核细胞浸润，第14天时肺泡炎性反应较前有所减轻，但成纤维细胞增生明显，胶原蛋白沉积在新生的毛细血管周围，肺泡间隔增宽，肺泡结构萎陷，肺泡腔被胶原蛋白及成纤维细胞填充。蜂毒低剂量组干预后与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。单纯的地塞米松组和蜂毒素中剂量组分别干预后，肺泡炎性反应和胶原蛋白沉积程度均较同一时间点的模型组有所减轻。而蜂毒素高剂量组能够明显减轻BLM诱导的小鼠肺组织纤维化程度。见图1、2。
2.2 蜂毒素组可有效减少胶原沉积和羟脯氨酸含量 单纯地塞米松组和蜂毒中剂量组分别干预后，第14天测定肺组织羟脯氨酸含量有所降低，这与Masson染色结果相对应。蜂毒高剂量组HYP含量在第14天降低更为明显，基本达到与正常对照组相接近的水平。见图3。
2.3 蜂毒素可有效降低纤维发生相关细胞因子的水平 在第7天、第14天用ELISA评估小鼠血清中TGF-β1、Collagen I/Ⅲ和MMP2/9的含量。我们发现模型组各时间点TGF-β1、Collagen I/Ⅲ和MMP2/9的含量明显升高。蜂毒低剂量组与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05），而地塞米松组、蜂毒中、高剂量组同一时间点各细胞因子含量均明显降低。见图4。
2.4 蜂毒素对肺组织中TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表达的影响 与对照组比较，模型组小鼠TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA在第14天时表达显著升高（P<0.01）;蜂毒素低剂量组与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）;与模型组比较蜂毒素中剂量组Smad3 mRNA表达降低（P<0.01），蜂毒素高剂量组TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表达明显降低（P<0.001），地塞米松组TGF-β1、Smad3 mRNA表达均明显降低（P<0.05）。见图5。
2.5 蜂毒素对肺组织中TGF-β1、Smad2/3、P-Smad2/3蛋白表达的影响 在第7天、第14天与对照组比较，模型组小鼠TGF-β1、Smad2/3、P-Smad2/3蛋白表达显著升高（P<0.01）;蜂毒素低剂量组与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05），蜂毒素中剂量组P-Smad2/3蛋白表达降低（P<0.01），蜂毒素高剂量组TGF-β1、P-Smad2/3蛋白表达明显降低（P<0.001）;地塞米松组TGF-β1、P-Smad2/3蛋白表达均明显降低（P<0.05）。见图6。 3 討论
PF的病理变化包括细胞外基质过度沉积、间质慢性炎性反应、成纤维细胞增殖和肺泡结构塌陷等[19-20]。国内外研究表明，细胞因子在纤维化疾病中扮演了至关重要的角色，特别是TGF-β1作为关键的上游致纤维化因子，具有多种生物学功能，能使成纤维细胞活化，胶原合成增加、ECM过度沉积而致纤维化[21-22]。Smads蛋白作为TGF-β家族的特异性细胞内信号转导分子，可以激活TGF-β，使Smad2和Smad3磷酸化[23]，其表达与PF的形成直接相关[24]。Sriram[25]等研究博来霉素诱导PF大鼠模型中发现，TGF-β1和Smad3在PF大鼠体内显著表达，ECM沉积明显，给药后TGF-β1、Smad3以及胶原表达均显著降低。积聚在肺间质中的胶原，主要以Ⅰ型和Ⅲ型胶原为主[26]。纤维细胞分泌几种MMP，包括MMP-2，MMP-7，MMP-8和MMP-9[27]。MMP-9和MMP-2它们的主要结构和底物具有特异性[28]。最近研究发现[29]MMPS具有多种生物学功能，其中MMP-2和MMP-9的抑制显着减弱了纤维细胞迁移和沉积。因此抑制胶原的合成与沉积，可以有效减轻PF。
纤维化可发生于各部位及多器官，引起组织器官内纤维结缔组织（硬结）增多，而研究[30]蜂针能消除纤维化结节。咖啡酸苯乙酯（Caffeic Acid Phenethyl Ester，CAPE）是一种天然的黄酮类化合物，是蜂胶中的主要成分。CAPE具有抗氧化、抗炎、抗癌，抗病毒和免疫调节的特性，已应用于多种疾病模型。刘瑞等[31]研究蜂胶提取物CAPE对大鼠PF的干预作用，结果显示肺组织纤维化程度，与BLM组比较，地塞米松（DEX）与CAPE联合观察组PF程度最弱，并且羟脯氨酸含量明显减低。辛绍杰[32]等观察蜂毒对144只大鼠实验性肝纤维化的疗效，结果表明观察组在肝纤维化完全形成后再给药，治疗3个月后发现，Ⅰ-Ⅲ级纤维化分别占54.5%和66.7%，明显轻于模型组。PARK等[33]研究结果显示蜂毒肽对于抑制肝脏炎性反应和纤维化有一定的效果，并且进一步[34]证明蜂毒肽是通过使cspase和基因蛋白bax的表达降低，以及体内细胞色素C的释放，使肝脏不受到损害。
我国拥有非常丰富的蜂毒资源，但对于蜂毒药理以及临床应用的研究、开发和利用目前还不够深入，故针对该方面的研究具有广阔的前景。本研究结果显示，小鼠在给予一次性气管穿刺注入博莱霉素后，运用蜂毒素进行干预，经过7 d和14 d，通过HE和Masson染色所见肺组织纤维化及胶原沉积程度明显较模型组减轻，且羟脯氨酸（HYP）含量亦有明显降低，且与地塞米松组无明显差异，说明蜂毒素可以有效抑制BLM诱导的小鼠肺组织纤维化程度。通过地塞米松组或蜂毒素中、高剂量单独干预后发现血清中TGF-β1、Collagen I/Ⅲ和MMP2/9含量均有明显减少，同时小鼠肺组织中的TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA的表达较模型组显著降低，说明蜂毒素可从基因和蛋白水平上减轻PF，其作用机制可能与抑制TGF-β/Smads信号传导通路有关。
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