近年来研究证明克雷伯杆菌易形成生物被膜（BF）［1］，关于生物被膜克雷伯杆菌产β-内酰胺酶活性的研究国内外尚未见到报道。本实验检测浮游克雷伯杆菌、生物被膜克雷伯杆菌及亚胺培南诱导后生物被膜克雷伯杆菌产β-内酰胺酶的能力，探讨生物被膜中克雷伯杆菌的耐药机制。 材料与方法材料：抗菌药物：亚胺培南（美国默沙东公司）。试剂：2.5%戊二醛、1%锇酸、枸橼酸铅等，均为国产分析醇。菌株：选取产β-内酰胺酶肺炎克雷伯杆菌30株（中国医科大学附属第二临床学院细菌室分离）。培养基：胰酶大豆肉汤（TSB，法国BioMerieux公司）。Nitrocefin （英国Oxiod公司）。器材：医用硅胶膜（北京医用硅胶研究所）；扫描电镜（S-800 日本Hitachi公司）；低温超速离心机（上海安亭公司）；可见紫外分光光度计：日本岛津制作所MIB-2000型外接岛津超级恒温水浴槽。方法：(1) 生物被膜的建立：取30株肺炎克雷伯杆菌，经37 ℃孵育24 h，配制成0.5 mol/L菌悬液，将每株菌菌悬液3等份分为3组，A组为浮游克雷伯杆菌，B组及C组菌以硅胶膜为载体，用改进的平板培养法［2］建立生物被膜，标本经固定、脱水、置换、干燥、枸橼酸铅染色等处理后通过扫描电镜观察鉴定［3］。(2) 诱导β-内酰胺酶产生：亚胺培南最低抑菌浓度(MIC)的测定，采用标准微量稀释法，其MIC值介于0.07～0.5 mg/L，将1/2 MIC亚胺培南加入C组菌悬液中孵育。(3) β-内酰胺酶粗酶提取液的制备：A、B、C 3组菌孵育至第3天，将细菌硅胶膜及胰酶大豆肉汤在超声水浴震荡（120 W，15 min）。提取的菌悬液于4 ℃ 6 000 r/min离心30 min，弃去上清液，以0.05 mol/L，pH 7.0磷酸钾缓冲液洗涤两次后，将收获的菌体悬浮在同样适量的缓冲液中，用冻融法［4］使细菌菌体破坏，然后以低温2 000 r/min离心60 min，上清液即为粗酶提取液。(4) β-内酰胺酶定性：用Nitrocefin纸片测定。(5) β-内酰胺酶活性测定：以Nitrocefin为底物，在紫外分光光度计波长482 nm处进行时间扫描测定酶活性。(6) 统计分析：对A组和B组、A组和C组、B组和C组数据进行配对t检验，分析差异的显著性。