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【摘 要】一次性使用无菌造影导管采用高压蒸汽灭菌，使用纸塑包装是否能有效的透过蒸汽，保证灭菌效果，同时对无菌的维持效果需要进一步验证，为此本文设计了一些试验，希望能够解决这一问题。设计试验时主要考虑黏附微生物的微粒的尺寸，温度、湿度和压力等环境条件以及这些条件的变化率，通过包装材料层的穿透率，包装材料的孔径和其他过滤参数。包装材料的空气不透过性，包装材料的微生物屏障性能，融合剂或粘合剂密封的不可穿透性和连续性，本文主要从生物、物理入手对产品包装袋的无菌可靠性进行了研究。
【关键词】纸塑包装袋；无菌检验；琼脂培养；碳粒机械震动；芽孢机械震动
一、灭菌效果的无菌检测
在产品最难灭菌部位放置菌片，将包装袋按正常程序包装，热合。
1.1菌片试验
菌片：嗜热脂肪芽孢杆菌
培养基：营养肉汤培养基
把该培养基的成分配比混合溶解，调节PH值为弱碱性后煮沸并分装、调节PH值使灭菌后为7.2±0.2。将各布点位置的菌片接种在该培养基中，在57℃恒温箱中培养7天。定时观察并记录有无嗜热脂肪芽孢杆菌菌落生长。
1.2产品无菌检验
检验操作环境：洁净度万级，温度18-28℃，湿度45%-65%
操作台环境：百级超净工作台，单向流空气环
1.2.1培养基无菌验证：将已灭菌的乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基各取5支分别在35℃和24℃恒温培养箱中培养14天，均应无菌生长。
1.2.2纸塑包装袋无菌检查
按照包装袋面积：0.9%无菌氯化钠溶液为10cm2：1ml的比例，用10ml注射器吸取该浸提液，吸取完毕后将浸提液以10ml/min的速度冲洗包装袋内壁。
将纸塑包装带的各布点位置截成5cm长的小段，放入无菌袋子中，按上步骤中吸取浸提液的比例加入浸提液并密闭该无菌袋，人为的以30次/分钟的速度振摇，将浸提液作为检验用液，收集浸提液于无菌容器中，将检验用液分成三份，用薄膜过滤法分别将其过滤，再用0.9%无菌氯化钠溶液反复三次冲洗滤膜，将冲洗完毕的滤膜分别置于含20ml硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基的试管中，其中一份作为阳性对照。
阳性对照的制备：方法一是同样使用薄膜过滤法，在最后一步冲洗时加入确定好稀释级别的金黄色葡萄球菌；另外一种方法是将确定好稀释级的金黄色葡萄球菌直接接种到培养基中，培养48—72小时应生长良好。
阴性对照：薄膜过滤法，直接将0.9%无菌氯化钠溶液倒于滤膜上放入培养基培养。无菌生长。
将上述培养基恒温培养14天。培养期间应逐日观察并记录是培养基的无菌状态。如在非阴性对照品培养过程中，培养基浑浊，不能从外观上判断有无微生物生长，14天后可取适量的该培养基液转种至同种新鲜培养基中，细菌培养2天、真菌培养3天，观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑浊。
结果判断：
若供试品和阴性对照均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定；若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非能充分证明试验结果无效。产品确认无菌后，进行下一步试验。
二、琼脂接触攻击试验
1.试验方法：
1.1菌液制备：
菌种：金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26 003]
将金黄色葡萄球菌的新鲜培养物接种至营养肉汤培养基中， 35 ℃恒温箱中培养24小时。将菌液用0.9%无菌氯化钠注射液10倍系列稀释，用希里格式血球记数板在显微镜下记数，使菌液中微生物的效价为106cfu/ml。
1.2制备平板：将无菌培养皿内倒入45℃左右的营养琼脂培养基15-20毫升，凝固后倒置恒温培养箱中35℃培养24小时。验证无菌落生长。
1.3琼脂接触攻击试验：在洁净操作台上将灭菌后的产品纸塑包装带按照布点位置截成小段放置在平板上，在分别将上述制备好的金黄色葡萄球菌液滴加在包装袋小段上，没平板用量为1ml。
阴性对照：在无菌环境中，将灭菌后的产品纸塑包装带按照布点位置截成小段放置在平板上，不滴加菌液。
阳性对照：将1ml金黄色葡萄球菌液直接滴加在营养琼脂培养基上。
1.4培养与观察：将供试品培养基、阳性对照培养基、阴性对照培养基放置于恒温培养箱中，30-35℃培养48小时，观察平板上是否有菌落生长。若供试品平板上有菌落生长，用显微镜观察菌落的类型，并用菌落计数器记录菌落数量。若供试品和阴性对照的平板上无任何菌落生长则该供试结果合格。
1.5试验结果：该步骤的试验品各部位均无菌生长，阴性无菌生长，阳性菌落生长良好。因此本文产品包装物检测合格。
三、碳粒机械震动试验
1.试验用品：粒径≤20μm的碳粒
2.试验步骤：
2.1将灭菌完成的密闭包装袋样品和1/2该样品重量的试验碳粒同时放入大塑料袋中，密闭，震摇8小时。
2.2结果观察：将灭菌完成的密闭包装袋样品从袋中取出，用75%酒精擦拭样品，用放大镜（×10）观察小包装内各部位（纸质、热合处、产品）有无碳粒。
2.3结果判断：应无碳粒渗入样品包装袋中。
四、细菌芽孢机械震动试验
1.试验步骤：
1.1菌液制备：
菌种：枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]
将枯草芽孢杆菌的新鲜培养物接种至营养肉汤培养基中，30-35℃培养24小时。将菌液用0.9%无菌氯化钠注射液作10倍系列稀释，用希里格式血球记数板在显微镜下记数，使菌液中微生物的效价为106cfu/ml。
1.2菌粒的制作：将菌液和麸皮按1：1的比例混合，恒温干燥。同时做菌粒环境污染的防止工作。
1.3震动：将样品：菌粒为10cm2:1g的比例配置，共同放入大塑料袋中，密闭8小时。
1.4生物试验：
1.4.1阳性对照：在非无菌条件下将灭菌完成的密闭包装袋样品从塑料袋中取出，用蘸有无菌生理盐水的棉签擦拭外包装，将棉签放入营养肉汤培养基中恒温培养。
阴性对照：将无菌棉签直接投入营养肉汤培养基中，放入恒温培养箱中。
供试品培养基制备：用75%酒精将外包装擦拭干净，在无菌室净化操作台上，分别用无菌棉签擦拭小包装内各部位（纸质、热合处、产品）将棉签分别置于营养肉汤培养基中，并标识。
五、结论
通过试验阳性阴性均成立，同时试验有效。检查过程简便容易操作，基本解决产品检验中的难题。
参考文献
[1]中华人民共和国药典2010版
[2]YY0267-2008心血管植入物和人工器官血液净化装置的体外循环血路
[3]微生物学使用手册
[4]EN868-1医用物品灭菌的包装材料和系统第一部分：通用要求和测试方法
[5]EN554 医疗用品的灭菌 – 湿热灭菌的验证和常规控制
[6]EN 20187 纸张、纸板和纸浆 –试样处理与试验的标准和监测（ISO 187:1990）[4]EN868-1医用物品灭菌的包装材料和系统第一部分：通用要求和测试方法
[5]EN554 医疗用品的灭菌 – 湿热灭菌的验证和常规控制
[6]EN 20187 纸张、纸板和纸浆 –试样处理与试验的标准和监测（ISO 187:1990）
【关键词】纸塑包装袋；无菌检验；琼脂培养；碳粒机械震动；芽孢机械震动
一、灭菌效果的无菌检测
在产品最难灭菌部位放置菌片，将包装袋按正常程序包装，热合。
1.1菌片试验
菌片：嗜热脂肪芽孢杆菌
培养基：营养肉汤培养基
把该培养基的成分配比混合溶解，调节PH值为弱碱性后煮沸并分装、调节PH值使灭菌后为7.2±0.2。将各布点位置的菌片接种在该培养基中，在57℃恒温箱中培养7天。定时观察并记录有无嗜热脂肪芽孢杆菌菌落生长。
1.2产品无菌检验
检验操作环境：洁净度万级，温度18-28℃，湿度45%-65%
操作台环境：百级超净工作台，单向流空气环
1.2.1培养基无菌验证：将已灭菌的乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基各取5支分别在35℃和24℃恒温培养箱中培养14天，均应无菌生长。
1.2.2纸塑包装袋无菌检查
按照包装袋面积：0.9%无菌氯化钠溶液为10cm2：1ml的比例，用10ml注射器吸取该浸提液，吸取完毕后将浸提液以10ml/min的速度冲洗包装袋内壁。
将纸塑包装带的各布点位置截成5cm长的小段，放入无菌袋子中，按上步骤中吸取浸提液的比例加入浸提液并密闭该无菌袋，人为的以30次/分钟的速度振摇，将浸提液作为检验用液，收集浸提液于无菌容器中，将检验用液分成三份，用薄膜过滤法分别将其过滤，再用0.9%无菌氯化钠溶液反复三次冲洗滤膜，将冲洗完毕的滤膜分别置于含20ml硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基的试管中，其中一份作为阳性对照。
阳性对照的制备：方法一是同样使用薄膜过滤法，在最后一步冲洗时加入确定好稀释级别的金黄色葡萄球菌；另外一种方法是将确定好稀释级的金黄色葡萄球菌直接接种到培养基中，培养48—72小时应生长良好。
阴性对照：薄膜过滤法，直接将0.9%无菌氯化钠溶液倒于滤膜上放入培养基培养。无菌生长。
将上述培养基恒温培养14天。培养期间应逐日观察并记录是培养基的无菌状态。如在非阴性对照品培养过程中，培养基浑浊，不能从外观上判断有无微生物生长，14天后可取适量的该培养基液转种至同种新鲜培养基中，细菌培养2天、真菌培养3天，观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑浊。
结果判断：
若供试品和阴性对照均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定；若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非能充分证明试验结果无效。产品确认无菌后，进行下一步试验。
二、琼脂接触攻击试验
1.试验方法：
1.1菌液制备：
菌种：金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26 003]
将金黄色葡萄球菌的新鲜培养物接种至营养肉汤培养基中， 35 ℃恒温箱中培养24小时。将菌液用0.9%无菌氯化钠注射液10倍系列稀释，用希里格式血球记数板在显微镜下记数，使菌液中微生物的效价为106cfu/ml。
1.2制备平板：将无菌培养皿内倒入45℃左右的营养琼脂培养基15-20毫升，凝固后倒置恒温培养箱中35℃培养24小时。验证无菌落生长。
1.3琼脂接触攻击试验：在洁净操作台上将灭菌后的产品纸塑包装带按照布点位置截成小段放置在平板上，在分别将上述制备好的金黄色葡萄球菌液滴加在包装袋小段上，没平板用量为1ml。
阴性对照：在无菌环境中，将灭菌后的产品纸塑包装带按照布点位置截成小段放置在平板上，不滴加菌液。
阳性对照：将1ml金黄色葡萄球菌液直接滴加在营养琼脂培养基上。
1.4培养与观察：将供试品培养基、阳性对照培养基、阴性对照培养基放置于恒温培养箱中，30-35℃培养48小时，观察平板上是否有菌落生长。若供试品平板上有菌落生长，用显微镜观察菌落的类型，并用菌落计数器记录菌落数量。若供试品和阴性对照的平板上无任何菌落生长则该供试结果合格。
1.5试验结果：该步骤的试验品各部位均无菌生长，阴性无菌生长，阳性菌落生长良好。因此本文产品包装物检测合格。
三、碳粒机械震动试验
1.试验用品：粒径≤20μm的碳粒
2.试验步骤：
2.1将灭菌完成的密闭包装袋样品和1/2该样品重量的试验碳粒同时放入大塑料袋中，密闭，震摇8小时。
2.2结果观察：将灭菌完成的密闭包装袋样品从袋中取出，用75%酒精擦拭样品，用放大镜（×10）观察小包装内各部位（纸质、热合处、产品）有无碳粒。
2.3结果判断：应无碳粒渗入样品包装袋中。
四、细菌芽孢机械震动试验
1.试验步骤：
1.1菌液制备：
菌种：枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]
将枯草芽孢杆菌的新鲜培养物接种至营养肉汤培养基中，30-35℃培养24小时。将菌液用0.9%无菌氯化钠注射液作10倍系列稀释，用希里格式血球记数板在显微镜下记数，使菌液中微生物的效价为106cfu/ml。
1.2菌粒的制作：将菌液和麸皮按1：1的比例混合，恒温干燥。同时做菌粒环境污染的防止工作。
1.3震动：将样品：菌粒为10cm2:1g的比例配置，共同放入大塑料袋中，密闭8小时。
1.4生物试验：
1.4.1阳性对照：在非无菌条件下将灭菌完成的密闭包装袋样品从塑料袋中取出，用蘸有无菌生理盐水的棉签擦拭外包装，将棉签放入营养肉汤培养基中恒温培养。
阴性对照：将无菌棉签直接投入营养肉汤培养基中，放入恒温培养箱中。
供试品培养基制备：用75%酒精将外包装擦拭干净，在无菌室净化操作台上，分别用无菌棉签擦拭小包装内各部位（纸质、热合处、产品）将棉签分别置于营养肉汤培养基中，并标识。
五、结论
通过试验阳性阴性均成立，同时试验有效。检查过程简便容易操作，基本解决产品检验中的难题。
参考文献
[1]中华人民共和国药典2010版
[2]YY0267-2008心血管植入物和人工器官血液净化装置的体外循环血路
[3]微生物学使用手册
[4]EN868-1医用物品灭菌的包装材料和系统第一部分：通用要求和测试方法
[5]EN554 医疗用品的灭菌 – 湿热灭菌的验证和常规控制
[6]EN 20187 纸张、纸板和纸浆 –试样处理与试验的标准和监测（ISO 187:1990）[4]EN868-1医用物品灭菌的包装材料和系统第一部分：通用要求和测试方法
[5]EN554 医疗用品的灭菌 – 湿热灭菌的验证和常规控制
[6]EN 20187 纸张、纸板和纸浆 –试样处理与试验的标准和监测（ISO 187:1990）