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【摘 要】 目的：建立高效液相色谱法测定小柴胡颗粒中黄芩苷含量的不确定度评价方法。方法：采用高效液相色谱法测定小柴胡颗粒中黄芩苷含量。根据检验过程，建立数学模型，分析影响其不确定度因素来源，对各个不确定度因素进行评定，得出扩展不确定度。结果：实验的扩展不确定度为U=0.02mg/袋（k=2）。结论：高效液相色谱法测定小柴胡中黄芩苷含量的不确定度主要由对照品称量、稀释过程和测得的色谱峰面积引入。
【关键词】 小柴胡颗粒；黄芩苷；高效液相色谱法；不确定度分析
【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2015）11-0011-03
测量不确定度是表征合理赋予被测量之值的分散性，与测量结果相关联的参数，是用来确定测量结果的可信程度[1]。目前，测量不确定度在药品检验分析领域的应用也日益广泛[2-3]。笔者根据《测量不确定度评定与表示》[1]，并参考《化学分析中不确定度的评估指南》[4]，对《中国药典》2010年版一部小柴胡颗粒[5]中黄芩苷的HPLC含量测定进行不确定度分析，以期找出影响不确定度的因素，并对其评定，计算合成不确定度，给出测量结果的扩展不确定度，为测量结果的准确提供依据。
1 仪器和试药
1.1 仪器 Waters2695-2487高效液相色谱仪；德国sartorius电子分析天平（型号：CP225D、CP224S）。
1.2 材料 黄芩苷对照品（批号：110715-201318，中国药品生物制品检定所提供）；小柴胡颗粒（批号：140506，广州白云山光华制药股份有限公司）。甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂为分析纯。
2 实验方法
2.1 色谱条件 色谱柱：资生堂 MG C18 （250×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇-水-磷酸（47：53：0.2）；检测波长：315nm；柱温：30℃；流速：1.0ml/min。理论板数按黄芩苷峰计算不低于8000。
2.2 对照品溶液的制备 称取黄芩苷对照品约12mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加70%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取5ml置20ml容量瓶中，用70%乙醇稀释至刻度，制成每1ml含黄芩苷60μg的溶液，作为对照品溶液[8]。
2.3 供试品溶液的制备 取装量差异项下的本品，混匀，取适量，研细，取约3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50ml，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率50kHz）30min，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液[8]。
2.4 测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，按外标法（峰面积）计算出样品中黄芩苷的含量。
2.5 实验数据 小柴胡颗粒的平均装量为10.2283g/袋，其余数据见表1、2。
3 测量数学模型的建立
根据测定原理，黄芩苷含量计算公式如下：
X=A样×W对×P对×V样×WV对×A对×W样
式中：供试品每袋含黄芩苷的含量（mg/袋）；A样：供试品的峰面积；A对：对照品的峰面积；W对：对照品的称取量（mg）；W样：供试品的取样量（g）；P对：对照品的纯度（%）； V样：样品的稀释体积（ml）；V对：对照品的稀释体积（ml）；W—：平均装量（g/袋）。
4 不确定度来源的识别及分析
4.1 不确定度的来源 由上述实验过程和数学模型可知，影响小柴胡颗粒中黄芩苷含量测定结果的不确定度因素有：供试品和对照品称量过程、稀释过程；仪器测定供试品和对照品峰面积的重复性；样品平均装量的称量；对照品的纯度以及其它因素。几个分量的影响因素相互独立，按测量不确定度评估程序，分别进行不确定度的分析评估。
4.2 对照品引入的不确定度
4.2.1 对照品称量引入的相对标准不确定度：
称量使用德国sartoriusCP225D电子分析天平（Max80g，d=0.01mg），为1级工作天平。①天平示值不确定度：天平的检定证书给出其示值最大允差为±0.05mg（0≤m≤5000mg），按均匀分布k=3 计算，不确定度为μ1=0.053 = 2.89×10 - 2mg。②天平称量重复性不确定度：天平检定证书给出的重复性误差为0.02mg，按照均匀分布计算，则标准不确定度为μ2=0.023 = 1.15×10 - 2mg。天平引入的不确定度为μ=μ12+ μ22 = 3.11×10 - 3，由于对照品采用的是减重法称量，称量了两次，所以对照品1称量引入的相对标准不确定度，同理对照品2称量引入的相对标准不确定度。对照品称量引入的相对标准不确定度。
4.2.2 对照品纯度引入的相对标准不确定度 黄芩苷对照品（批号：110715-201318，中国药品生物制品检定所）未提供不确定度值，假设分布区间的半峰宽为±0.05%，按均匀分布k=3，故由对照品纯度而引入的相对不确定度urel（P对）=0.053×93.3%=3.10×10-4
4.2.3 对照品稀释引入的相对标准不确定度 ①玻璃仪器校准的不确定度：属B类不确定度。对照品稀释过程中用到容量瓶50ml（A级）、20ml（A级），单标线吸管5ml（A级），容量允差分别为±0.05、±0.03、±0.015，在一个有效的生产过程中标定值比极限值出现的可能性更高，按三角分布计算优于均匀分布，k=6。②温度：实验时容量瓶、吸管和溶液的温度与玻璃仪器校准（20℃）的温度差异变化为±5℃，水的膨胀系数为2.1×10-4，属于B类不确定度，按矩形分布评定。由表3结合对照品的稀释过程，对照品稀释引入的相对合成标准不确定度为：urel（V对）=u2rel（V50）+u2rel（V25）+u2rel（V5）=1.43×10-3。 4.2.4 对照品峰面积引入的相对标准不确定度：urel（A对）对照品溶液A对1、A对2分别进样2次，均以色谱峰面积计算。对照品溶液1峰面积分别为1312423和1312944，平均峰面积为1312684采用极差法计算，n=2，C=1.13，同理对照品溶液2峰面积分别为1262733和1266039，对照品峰面积引入的相对标准不确度。
4.3 供试品引入的不确定度
4.3.1 供试品称量引入的相对标准不确定度 称量使用德国sartoriusCP224S电子分析天平（Max220g，d=0.1mg），为1级工作天平。①天平示值不确定度：天平的检定证书给出其示值最大允差为±0.5mg（50g≤m≤200g），按均匀分布k=3计算，不确定度为u1=0.53 =0.2887mg。②天平称量重复性不确定度：天平检定证书给出的重复性误差为0.1mg，按照均匀分布计算，则标准不确定度为u2=0.13 = 0.0577mg。天平引入的不确定度为u=u2+ u22=0.2944，所以供试品1称量引入的相对标准不确定度为；同理，供试品2称量引入的相对标准不确定度为9.81×10-5，则供试品称量引入的相对标准不确定度：urel（W样）=u2rel（W样1）+u2rel（W样2）2=9.81×10-5
4.3.2 供试品稀释过程引入的相对标准不确定度 供试品配制过程中只使用了1个A级50ml单标线吸管，容量允差±0.05，按三角分布：k=6 ，引入的相对不确定度为7.31×10-4（见表3）。
4.3.3 供试品峰面积引入的相对标准不确定度 供试品溶液各进样2次，均以色谱峰面积计算。采用极差法计算，n=2，C=1.13；进样10μl时urel（A样1）=RC×A样1=2643964-26356711.13×2639817=2.78×10-3，urel（A样2）=RC×A样2=2645071-26380731.13×2641772=2.21×10-3供试品峰面积引入的相对标准不确定度：urel（A样）=urel2（A样）+urel2（A样2）2=2.51×10-3
4.3.4 供试品平均装量引入的相对标准不确定度urel（W）本品平均装量10.2283g/袋，参照供试品称量引入的相对不确定度，平均装量引入的相对不确定度urel（W）=uW=0.294410228.3 = 2.87×10-5
4.4 合成相对标准不确定度 各相对不确定度分量见表4。
4.5 扩展不确定度 本品测得小柴胡颗粒中黄芩苷含量X=20.2mg/袋，测得结果的合成标准不确定度为：uc（X）=X×urel（X）=20.2×5.04×10-3=0.101mg/袋。
按95%的置信概率，取包含因子k=2，扩展不确定度：U=k×uc（X）=2×0.101=0.2mg/袋。
4.6 不确定度测量报告 根据不确定度评定结果，小柴胡颗粒中黄芩苷的含量测定结果可表示为：X=（20.2±0.2）mg/袋。
5 讨论
试验对小柴胡颗粒中黄芩苷含量进行了不确定度分析评定，由评定结果可以看出（见表1），测得色谱峰面积、对照品称量和对照品稀释过程对不确定度贡献比较大，对照品纯度、样品称量及样品稀释过程、样品的平均装量对不确定度贡献较小。
不确定度评定结果提示，在今后在实际检验过程中，首先要保证实验所用的仪器、计量器具等均应计量检定合格，并注意日常的维护和保养，对照品的称量应选择合适量程及精度的电子分析天平，以提高检测的灵敏度和准确性；其次在实验时适当增加对照品的取样量、稀释过程尽可能选用容量相对较大的量具并尽可能减少稀释步骤，增加平行样测定，也可以适当减少不确定度分量所占的比重。
采用外标一点法进行定量分析时，应尽量使配制的样品组分的浓度与对照品浓度接近，以降低实验误差。本文中供试品溶液按标准检验进样10μl，样品中黄芩苷的峰面积是黄芩苷对照品峰面积的两倍，测定结果为20.2mg/袋；而进样5μl，样品中黄芩苷的峰面积与黄芩苷对照品峰面积接近，测定结果为19.3mg/袋。两个测定结果一个高于限度，一个低于限度，但不确定度基本相同。分析其原因是供试品溶液进样10μl，采用外标一点法计算时产生了较大的实验误差。《中国药典》2010年版一部小柴胡颗粒[4]项下规定：本品每袋含黄芩以黄芩苷（C21H18O11）计，不得少于20.0mg。按样品的取样量、稀释倍数和规定限度折算，黄芩苷对照品溶液的配制浓度应为120μg/ml。但标准中规定对照品配制浓度应为60μg/ml，本实验的测定结果表明该含量测定方法存在着一定缺陷，需在今后质量标准提高中进行进一步完善。
参考文献
[1] 国家质量监督检验检疫总局.JJF1059.1-2012测量不确定度评定与表示[S]. 北京：中国质检出版社，2013.
[2] 文屏，王建文，高咏莉，等. 三七中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1含量的测量不确定度评定[J]. 内蒙古中医药，2013，（31）：115-117.
[3] 刘丽娜，金红宇，毛歆，等. 酸枣仁中黄曲霉毒素B1残留测定的不确定度评定[J]. 中国药学杂志，2012，47（21）：1754-1759.
[4] 中国合格评定国家认可委员会.CNAS-GL06 化学分析中不确定度的评估指南[S]. 北京：中国计量出版社，2006.
[5] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S]. 北京：中国医药科技出版社，2010：475-476.
【关键词】 小柴胡颗粒；黄芩苷；高效液相色谱法；不确定度分析
【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2015）11-0011-03
测量不确定度是表征合理赋予被测量之值的分散性，与测量结果相关联的参数，是用来确定测量结果的可信程度[1]。目前，测量不确定度在药品检验分析领域的应用也日益广泛[2-3]。笔者根据《测量不确定度评定与表示》[1]，并参考《化学分析中不确定度的评估指南》[4]，对《中国药典》2010年版一部小柴胡颗粒[5]中黄芩苷的HPLC含量测定进行不确定度分析，以期找出影响不确定度的因素，并对其评定，计算合成不确定度，给出测量结果的扩展不确定度，为测量结果的准确提供依据。
1 仪器和试药
1.1 仪器 Waters2695-2487高效液相色谱仪；德国sartorius电子分析天平（型号：CP225D、CP224S）。
1.2 材料 黄芩苷对照品（批号：110715-201318，中国药品生物制品检定所提供）；小柴胡颗粒（批号：140506，广州白云山光华制药股份有限公司）。甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂为分析纯。
2 实验方法
2.1 色谱条件 色谱柱：资生堂 MG C18 （250×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇-水-磷酸（47：53：0.2）；检测波长：315nm；柱温：30℃；流速：1.0ml/min。理论板数按黄芩苷峰计算不低于8000。
2.2 对照品溶液的制备 称取黄芩苷对照品约12mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加70%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取5ml置20ml容量瓶中，用70%乙醇稀释至刻度，制成每1ml含黄芩苷60μg的溶液，作为对照品溶液[8]。
2.3 供试品溶液的制备 取装量差异项下的本品，混匀，取适量，研细，取约3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50ml，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率50kHz）30min，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液[8]。
2.4 测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，按外标法（峰面积）计算出样品中黄芩苷的含量。
2.5 实验数据 小柴胡颗粒的平均装量为10.2283g/袋，其余数据见表1、2。
3 测量数学模型的建立
根据测定原理，黄芩苷含量计算公式如下：
X=A样×W对×P对×V样×WV对×A对×W样
式中：供试品每袋含黄芩苷的含量（mg/袋）；A样：供试品的峰面积；A对：对照品的峰面积；W对：对照品的称取量（mg）；W样：供试品的取样量（g）；P对：对照品的纯度（%）； V样：样品的稀释体积（ml）；V对：对照品的稀释体积（ml）；W—：平均装量（g/袋）。
4 不确定度来源的识别及分析
4.1 不确定度的来源 由上述实验过程和数学模型可知，影响小柴胡颗粒中黄芩苷含量测定结果的不确定度因素有：供试品和对照品称量过程、稀释过程；仪器测定供试品和对照品峰面积的重复性；样品平均装量的称量；对照品的纯度以及其它因素。几个分量的影响因素相互独立，按测量不确定度评估程序，分别进行不确定度的分析评估。
4.2 对照品引入的不确定度
4.2.1 对照品称量引入的相对标准不确定度：
称量使用德国sartoriusCP225D电子分析天平（Max80g，d=0.01mg），为1级工作天平。①天平示值不确定度：天平的检定证书给出其示值最大允差为±0.05mg（0≤m≤5000mg），按均匀分布k=3 计算，不确定度为μ1=0.053 = 2.89×10 - 2mg。②天平称量重复性不确定度：天平检定证书给出的重复性误差为0.02mg，按照均匀分布计算，则标准不确定度为μ2=0.023 = 1.15×10 - 2mg。天平引入的不确定度为μ=μ12+ μ22 = 3.11×10 - 3，由于对照品采用的是减重法称量，称量了两次，所以对照品1称量引入的相对标准不确定度，同理对照品2称量引入的相对标准不确定度。对照品称量引入的相对标准不确定度。
4.2.2 对照品纯度引入的相对标准不确定度 黄芩苷对照品（批号：110715-201318，中国药品生物制品检定所）未提供不确定度值，假设分布区间的半峰宽为±0.05%，按均匀分布k=3，故由对照品纯度而引入的相对不确定度urel（P对）=0.053×93.3%=3.10×10-4
4.2.3 对照品稀释引入的相对标准不确定度 ①玻璃仪器校准的不确定度：属B类不确定度。对照品稀释过程中用到容量瓶50ml（A级）、20ml（A级），单标线吸管5ml（A级），容量允差分别为±0.05、±0.03、±0.015，在一个有效的生产过程中标定值比极限值出现的可能性更高，按三角分布计算优于均匀分布，k=6。②温度：实验时容量瓶、吸管和溶液的温度与玻璃仪器校准（20℃）的温度差异变化为±5℃，水的膨胀系数为2.1×10-4，属于B类不确定度，按矩形分布评定。由表3结合对照品的稀释过程，对照品稀释引入的相对合成标准不确定度为：urel（V对）=u2rel（V50）+u2rel（V25）+u2rel（V5）=1.43×10-3。 4.2.4 对照品峰面积引入的相对标准不确定度：urel（A对）对照品溶液A对1、A对2分别进样2次，均以色谱峰面积计算。对照品溶液1峰面积分别为1312423和1312944，平均峰面积为1312684采用极差法计算，n=2，C=1.13，同理对照品溶液2峰面积分别为1262733和1266039，对照品峰面积引入的相对标准不确度。
4.3 供试品引入的不确定度
4.3.1 供试品称量引入的相对标准不确定度 称量使用德国sartoriusCP224S电子分析天平（Max220g，d=0.1mg），为1级工作天平。①天平示值不确定度：天平的检定证书给出其示值最大允差为±0.5mg（50g≤m≤200g），按均匀分布k=3计算，不确定度为u1=0.53 =0.2887mg。②天平称量重复性不确定度：天平检定证书给出的重复性误差为0.1mg，按照均匀分布计算，则标准不确定度为u2=0.13 = 0.0577mg。天平引入的不确定度为u=u2+ u22=0.2944，所以供试品1称量引入的相对标准不确定度为；同理，供试品2称量引入的相对标准不确定度为9.81×10-5，则供试品称量引入的相对标准不确定度：urel（W样）=u2rel（W样1）+u2rel（W样2）2=9.81×10-5
4.3.2 供试品稀释过程引入的相对标准不确定度 供试品配制过程中只使用了1个A级50ml单标线吸管，容量允差±0.05，按三角分布：k=6 ，引入的相对不确定度为7.31×10-4（见表3）。
4.3.3 供试品峰面积引入的相对标准不确定度 供试品溶液各进样2次，均以色谱峰面积计算。采用极差法计算，n=2，C=1.13；进样10μl时urel（A样1）=RC×A样1=2643964-26356711.13×2639817=2.78×10-3，urel（A样2）=RC×A样2=2645071-26380731.13×2641772=2.21×10-3供试品峰面积引入的相对标准不确定度：urel（A样）=urel2（A样）+urel2（A样2）2=2.51×10-3
4.3.4 供试品平均装量引入的相对标准不确定度urel（W）本品平均装量10.2283g/袋，参照供试品称量引入的相对不确定度，平均装量引入的相对不确定度urel（W）=uW=0.294410228.3 = 2.87×10-5
4.4 合成相对标准不确定度 各相对不确定度分量见表4。
4.5 扩展不确定度 本品测得小柴胡颗粒中黄芩苷含量X=20.2mg/袋，测得结果的合成标准不确定度为：uc（X）=X×urel（X）=20.2×5.04×10-3=0.101mg/袋。
按95%的置信概率，取包含因子k=2，扩展不确定度：U=k×uc（X）=2×0.101=0.2mg/袋。
4.6 不确定度测量报告 根据不确定度评定结果，小柴胡颗粒中黄芩苷的含量测定结果可表示为：X=（20.2±0.2）mg/袋。
5 讨论
试验对小柴胡颗粒中黄芩苷含量进行了不确定度分析评定，由评定结果可以看出（见表1），测得色谱峰面积、对照品称量和对照品稀释过程对不确定度贡献比较大，对照品纯度、样品称量及样品稀释过程、样品的平均装量对不确定度贡献较小。
不确定度评定结果提示，在今后在实际检验过程中，首先要保证实验所用的仪器、计量器具等均应计量检定合格，并注意日常的维护和保养，对照品的称量应选择合适量程及精度的电子分析天平，以提高检测的灵敏度和准确性；其次在实验时适当增加对照品的取样量、稀释过程尽可能选用容量相对较大的量具并尽可能减少稀释步骤，增加平行样测定，也可以适当减少不确定度分量所占的比重。
采用外标一点法进行定量分析时，应尽量使配制的样品组分的浓度与对照品浓度接近，以降低实验误差。本文中供试品溶液按标准检验进样10μl，样品中黄芩苷的峰面积是黄芩苷对照品峰面积的两倍，测定结果为20.2mg/袋；而进样5μl，样品中黄芩苷的峰面积与黄芩苷对照品峰面积接近，测定结果为19.3mg/袋。两个测定结果一个高于限度，一个低于限度，但不确定度基本相同。分析其原因是供试品溶液进样10μl，采用外标一点法计算时产生了较大的实验误差。《中国药典》2010年版一部小柴胡颗粒[4]项下规定：本品每袋含黄芩以黄芩苷（C21H18O11）计，不得少于20.0mg。按样品的取样量、稀释倍数和规定限度折算，黄芩苷对照品溶液的配制浓度应为120μg/ml。但标准中规定对照品配制浓度应为60μg/ml，本实验的测定结果表明该含量测定方法存在着一定缺陷，需在今后质量标准提高中进行进一步完善。
参考文献
[1] 国家质量监督检验检疫总局.JJF1059.1-2012测量不确定度评定与表示[S]. 北京：中国质检出版社，2013.
[2] 文屏，王建文，高咏莉，等. 三七中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1含量的测量不确定度评定[J]. 内蒙古中医药，2013，（31）：115-117.
[3] 刘丽娜，金红宇，毛歆，等. 酸枣仁中黄曲霉毒素B1残留测定的不确定度评定[J]. 中国药学杂志，2012，47（21）：1754-1759.
[4] 中国合格评定国家认可委员会.CNAS-GL06 化学分析中不确定度的评估指南[S]. 北京：中国计量出版社，2006.
[5] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S]. 北京：中国医药科技出版社，2010：475-476.