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摘 要：為研究胡椒不同时期体细胞胚中内源激素变化，以‘热引1号’胡椒外种皮经培养获得的非胚性愈伤组织（Y）、胚性愈伤组织（P）、胚性愈伤组织与体细胞胚混合物（H）、体细胞胚（T）与体细胞胚增殖（Z）5个时期样品为试验材料，采用LC-MS/MS技术检测不同时期胚性培养物的内源激素种类与含量，以期找出内源激素影响胡椒体细胞胚发生的关键因素。结果表明：在胡椒体细胞胚发生过程中，吲哚-3-乙酸（IAA）含量在H时期最高，在P时期最低，在H、T与Z时期逐渐降低。吲哚-3-丁酸（IBA）含量在Y时期最高，在P时期最低，在H、T与Z时期基本不变。吲哚-3-甲酸（ICA）含量在H时期最高，且只存在含有愈伤组织的Y、P与H时期。异戊烯腺嘌呤（IP）含量在H时期最高，在P时期最低，在T与Z时期接近于零。顺式玉米素（cZ）含量在Y时期最高，其他时期都接近于零。茉莉酸甲酯（ME-JA）含量只存在Y时期和P时期，但Y时期含量高于P时期。茉莉酸（JA）含量在Z时期最高，在P时期最低，在H、T与Z时期逐渐升高。水杨酸（SA）含量在H时期最高，在Y时期最低，且H、T与Z时期先降后升。脱落酸（ABA）含量在H时期最高，在P时期最低，在T与Z时期基本不变。赤霉素类（GAS）主要存在于Y与P时期，H、T与Z时期含量很低。由此可见，IAA、SA与ABA可能与体细胞胚发生的相关性强，而cZ、MEJA与GAS可能与愈伤组织产生相关性强。
关键词：胡椒;愈伤组织;体细胞胚;内源激素
中图分类号：S667.1 文献标识码：A
Changes of Endogenous Hormone During Different Stages of Somatic Embryogenesis of Piper nigrum
JI Xunzhi1，2，3，4， HU Lisong1，2，3，4， QIN Xiaowei1，2，3，4， YANG Yiqiu1，5， FAN Rui1，2，3，4， HAO Chaoyun1，2，3，4*
1. Spice and Beverage Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Wanning， Hainan 571533， China; 2. Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of Spice and Beverage Crops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Wanning， Hainan 571533， China; 3. Hainan Provincial Key Laboratory of Genetic Improvement and Quality Regulation for Tropical Spice and Beverage Crops， Wanning， Hainan 571533， China; 4. Hainan Sim Soonliang academician workstation， Wanning， Hainan 571533， China; 5. College of Tropical Crop， Yunnan Agricultural University， Pu’er， Yunnan 665000， China
Abstract： In order to investigate the changes of endogenous hormones during different stages of somatic embryogenesis of P. nigrum， the endogenous hormones in five different development processes were detected at non-embryonic callus stage （Y）， embryonic callus stage （P）， mixed stage of embryonic callus and somatic embryo （H）， somatic embryo stage （T） and stage of somatic embryo proliferation （Z） by the LC-MS/MS technique. The content of indole-3-acetic acid （IAA） decreased gradually in the period of H， T and Z during the process of pepper somatic embryogenesis. The content of indole-3-butyric acid （IBA） was the highest in the period of Y and the lowest in the period of P， and the content of IBA was basically unchanged in the period of H， T and Z. Indole-3- Formic acid （ICA） content was the highest in the period of H， and ICA only existed at callus stage. Isopentenyladenine （IP） content was the highest at H， and was the lowest at P and close to zero at T and Z. Zeatin （cZ） content was the highest at Y， and cZ content was close to zero at other stages. Methyl jasmonate （ME-JA） only existed at Y and P， and former content was higher than latter content. Jasmonic acid （JA） content was the highest at Z， JA content was the lowest at P and increased gradually at other stages. Salicylic acid （SA） content was the highest at H， and was the lowest at Y and increased after decreased at other stages. Abscisic acid （ABA） content was the highest at H， and was the lowest at P and unchanged basically at T and Z. Gibberellins （GAS） mainly existed at Y and P， the levels were low at H， T， and Z. Therefore， IAA， SA and ABA may be strongly correlated with somatic embryogenesis， while cZ， ME-JA and GAS may be strongly correlatws with callus production. Keywords： Piper nigrum L.; callus; somatic embryogenesis; endogenous hormones
DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.04.013
胡椒（Piper nigrum L.）为多年生热带攀援藤本植物，果实具有辛辣香气，是世界最重要的香辛料作物，也是人们喜爱的调味品[1-2]。目前，我国以‘热引1号’胡椒为主栽品种，种苗来源一直以主蔓插条培育为主[3-4]。此法具有能够稳定保持种苗优良性状、后代发病率低等优点，但对其母株选择、苗圃规划、种苗培育环境与日常管理有较高要求，并且易受天气和人为因素的影响，成本高、周期长，无法满足产业发展对于大量优质种苗的需求。植物组织培养技术是一种无性繁殖方式，通过体细胞胚发生进行植株再生，能够极大地保留品种的优良性状和提高种苗的繁育效率，因此，組织培养技术对于胡椒种苗繁育具有重要的实用价值。
植物激素在调控细胞分化和生长方面具有重要作用，并在体细胞胚发生与发育方面起着调节作用[5]。目前，针对植物体细胞胚发生过程中内源激素研究主要集中于龙眼[6]、荔枝[7]与橡胶[8]等热带经济作物。然而，不同植物品种的不同部位体细胞胚发生所需最佳培养条件各有不同，内源激素种类与浓度是影响体细胞胚发生的重要因素。本研究拟以‘热引1号’胡椒为研究对象，在胡椒体细胞胚发生过程中的非胚性愈伤组织、胚性愈伤组织、愈伤组织与体细胞胚混合物、体细胞胚与体细胞胚增殖5个时期，研究不同时期胚性培养物的内源激素种类和含量及与体细胞胚发生的关系，以期为进一步完善胡椒体细胞胚发生提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
挑取‘热引1号’胡椒外种皮，在MS培养基上25 ℃下暗培养60 d，获得非胚性愈伤组织及培养相同时间获得的胚性愈伤组织（图1）。A为胡椒外种皮，试验材料胡椒5个时期样品分别标记如下：B为非胚性愈伤组织（Y）;C为胚性愈伤组织（P）;D为胚性愈伤组织与体细胞胚混合物（H）;E为体细胞胚（T）;F为体细胞胚增殖（Z）。对P光培养40 d，对H进行取样;继续对P光培养90 d，再次挑取完全的T;继续对T光培养30 d，再次进行取样。每次取样后，立即对样品用液氮速冻后进行?80 ℃的低温保存。实验重复3次。
1.2 方法
1.2.1 激素标准曲线的制作 参照Malgorzata等[9]的方法，称取激素标准品，用甲醇（色谱纯）充分溶解后，取该溶液稀释后配制成母液，再进行等度稀释，以峰面积为纵坐标，标准品浓度为横坐标制作标准曲线。
1.2.2 粗提液的制备 参照?imura等[10]的方法，称取材料50 mg，重复3次，加入1 mL的激素提取剂进行研磨，取上清液，重复提取3次，进行冷冻高压冻干后，加入1 mL甲醇（色谱纯）重新溶解，用0.45 μm微孔滤膜过滤后，低温保存，备用。
1.2.3 LC-MS/MS检测条件 （1）色谱条件。参照Floková等[11]的方法，色谱柱为Waters色谱柱（Acquity Uplc Hss T3 C18 1.8 ?m，2.1 mm×100 mm）。流动相：超纯水与乙腈（色谱纯）的体积比按时间进行梯度洗脱，流速0.35 mL/min，时间0～8 min、8～9 min、9～12 min的水∶乙腈流动相体积比分别为95∶5、5∶95、95∶5。
（2）质谱条件。参照Cui等[12]与Xiao等[13]的方法，利用标准品确定激素标准品的母离子与子离子最佳响应条件，并记录最佳锥孔电压和碰撞电压。每个离子对根据优化的去簇电压（declustering potential， DP）和碰撞能（collision energy， CE）进行扫描检测（表1，图2）。样本中激素的含量采用以下公式计算：
样本中激素含量（ng/g）=BCD/1000。
式中，B为样本中激素积分峰面积比值代入标准曲线得到的浓度值（ng/mL）;C为复溶时所用溶液的体积（μL）;D为称取的样本质量（g）。
1.3 数据处理
用Analyst 1.6.1软件处理液相LC-MS/MS联用分析得到的质谱图数据，将检测到的所有样本激素的积分峰面积比值代入标准曲线线性方程进行计算，并代入计算公式，最终得到实际样本中
激素的绝对含量数据，并采用IBM SPSS Statistics 25.0与GraphPad Prism 8.0软件对数据进行ANOVA及相关性分析，生成图表并分析。
2 结果与分析
2.1 不同时期胡椒体细胞胚生长素类（Auxin）含量变化
如图3所示，在对不同发育时期吲哚-3-乙酸（IAA）进行测定发现，IAA含量在H时期最高达6.21 ng/g，在P时期IAA含量最低为0 ng/g。不过，在体细胞胚发生过程中的H、T与Z时期的IAA含量都显著高于不分化的Y时期，但在体细胞胚发生过程中，IAA含量逐渐降低。
在对不同发育时期吲哚-3-丁酸（IBA）进行测定发现，IBA含量在Y时期最高达1.15 ng/g，在P时期IBA含量最低为0.08 ng/g。在体细胞胚发生过程中的H、T与Z时期的IBA含量基本不变，但三者的IBA含量都显著低于Y时期。
在对不同发育时期吲哚-3-甲酸（ICA）进行测定发现，ICA含量在H时期最高达1.58 ng/g，在T和Z时期ICA含量最低为0 ng/g。另外ICA只存在含有愈伤组织的Y、P与H时期。 在同一时期的生长素类激素比较中，Y时期中的IBA含量最高;在P时期中的ICA含量最高;在体细胞胚发生的H、T与Z时期中的IAA含量最高。由相关结果分析可知，IAA可能与胡椒愈伤组织开始分化体细胞胚有关，而高含量的IBA可能与胡椒愈伤组织不分化有关。
不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
Different small letters represent extremely significant difference （P<0.05）.
2.2 不同时期胡椒体细胞胚细胞分裂素类（CTK）含量变化
如图4所示，在对不同发育时期异戊烯腺嘌呤（IP）进行测定发现，IP含量在H时期最高达6.21 ng/g，在P时期IP含量最低为0.01 ng/g。在体细胞胚发生后的T与Z时期的IP含量降低到0.03 ng/g，显著低于不分化的Y时期。
在对不同发育时期顺式玉米素（cZ）进行测定发现，cZ含量在Y时期最高达1.33 ng/g，其他时期的cZ含量都较低，为0.01 ng/g左右。
在同一時期的细胞分裂素类激素比较中，Y时期中的cZ含量最高;在P时期中的IP与cZ含量都接近于零;在体细胞胚发生的H、T与Z时期中的IP含量较高。由相关结果分析可知，cZ的存在可能与胡椒非胚性愈伤组织不分化有关，IP可能与胡椒体细胞胚发育有关。
不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
Different small letters represent extremely significant difference （P<0.05）.
2.3 不同时期胡椒体细胞胚茉莉酸类（JA）含量变化
如图5所示，在对不同发育时期茉莉酸甲酯（ME-JA）进行测定发现，ME-JA含量在Y时期最高达0.23 ng/g，在体细胞胚开始发生的H、T与Z时期的ME-JA含量降低到0 ng/g，但在P时期ME-JA含量也有0.19 ng/g。ME-JA只存在还未开始分化的愈伤组织里。
在对不同发育时期茉莉酸（JA）进行测定发现，JA含量在Z时期最高达2.56 ng/g，在P时期JA含量最低为0 ng/g。在体细胞胚发生过程中的H、T与Z时期的JA含量逐渐升高，但三者的JA含量都显著低于Y时期。
在同一时期的茉莉酸类激素比较中，Y时期中的JA含量最高;在P时期中的ME-JA含量较高;在体细胞胚发生的H、T与Z时期中的JA含量较高。由相关结果分析可知，JA可能与胡椒体细胞胚分化与发育有关，而ME-JA可能只与胡椒愈伤组织形成有关。
不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
Different small letters represent extremely significant difference （P<0.05）.
2.4 不同时期胡椒体细胞胚水杨酸（SA）与脱落酸（ABA）含量变化
如图6所示，在对不同发育时期水杨酸（SA）进行测定发现，SA含量在H时期最高达48.10 ng/g，在Y时期SA含量最低为15.27 ng/g。在体细胞胚开始发生的H、T与Z时期的SA含量先降后升，由T时期的18.13 ng/g升到Z时期的25.17 ng/g，且在P时期的SA含量也有19.17 ng/g。
在对不同发育时期脱落酸（ABA）进行测定发现，ABA含量在H时期最高达17.47 ng/g，在P时期ABA含量最低为0.17 ng/g。在体细胞胚发生后的T与Z时期的ABA含量基本不变，保持在5.80 ng/g，但二者的ABA含量都显著低于Y时期的11.03 ng/g。由相关结果分析可知，SA与ABA含量的升高可能与胡椒愈伤组织开始分化体细胞胚有关，但SA与ABA可能不利于胡椒体细胞胚进一步发育。
2.5 不同时期胡椒体细胞胚GAS类含量变化
如图7所示，在对不同发育时期赤霉素类（GAS）进行测定发现，GA3含量只存在P时期达0.26 ng/g，其他时候不含GA3含量。GA9在Y时期达到最高值0.31 ng/g，并显著高于体细胞胚开始发生的H与T时期含量。GA15在Y时期达
不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
Different small letters represent extremely significant difference （P<0.05）.
不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
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到最高值0.40 ng/g，在P时期含量最低为0.05 ng/g，在体细胞胚发生的H、T、Z时期呈先升后降，但各时期的GA15含量差异不显著。GA20存在Y、H、T与Z时期，其中H时期达最高值0.45 ng/g，其余时期含量都在0.35 ng/g左右，且各时期的GA20含量差异不显著。由相关结果分析可知，不同的GAS对胡椒体细胞胚发生影响不同，GA3可能与胡椒胚性愈伤组织形成有关，而高含量的GA9可能与胡椒非胚性愈伤组织形成有关，GA15与GA20可能在胡椒体细胞胚发生中起到辅助作用。
2.6 不同时期胡椒体细胞胚中不同内源激素含量的相关性分析
由表2可知，IAA与ICA、IP、SA、ABA均呈极显著正相关性（r = 0.815**，r = 0.948**，r = 0.932**，r = 0.809**），与ME-JA有显著负相关性（r =?0.537*）;IBA与cZ、ME-JA均有极显著正相关性（r = 0.983**，r = 0.659**）;ICA与IP、SA、ABA有极显著正相关性（r =0.905**，r = 0.749**，r = 0.865**）;IP与SA、ABA有极显著正相关性（r = 0.916**，r = 0.907**）;cZ与ME-JA有极显著正相关性（r =0.708**）;ME-JA与SA有显著正相关（r = 0.542*）;SA与ABA有极显著正相关性（r = 0.702**）;GA3与ABA有极显著负相关性（r = ?0.670**），与ME-JA有显著负相关性（r = ?0.638*）;GA9与IBA、cZ有极显著正相关性（r = 0.945**，r = 0.945**），与JA有显著正相关性（r = 0.614*）;GA15与IBA、GA9有显著正相关性（r = 0.514*，r = 0.556**）。由相关系数分析得知，IAA、ICA、IP、SA与ABA可能对胡椒体细胞胚发生的作用相同且密切相关，ME-JA、IBA与cZ的作用与IAA等相反，GAS中的GA3与GA9、GA15的作用不一致。 3 讨论
3.1 胡椒不同时期体细胞胚中的内源激素变化
植物激素对植物细胞的增殖分裂、结构分化与生命代谢等方面都具有重要的调节作用，而植
物体细胞胚发生与内源激素含量的变化密切相关，各种激素对植物体细胞胚胎发生有不同的影响[14-15]。在对龙眼体细胞胚发生过程中内源激素变化的研究中发现，IAA在胚性愈伤组织中含量大于非胚性愈伤组织，并在球形胚时期到达高峰[6]。在本研究中，通过对胡椒体细胞胚发生不同时期的内源激素研究发现，生长素类激素中，IAA可
能与胡椒体细胞胚的发生与发育有关，而IBA与ICA的高含量可能与抑制胡椒体细胞胚发生有关，与龙眼体细胞胚发生的研究结果相似。另外在对荔枝品种‘下番枝’体细胞胚发生过程中内源激素的研究中发现IAA含量上升对荔枝早期体胚发生具有促进作用[7]，而本研究结果与其IAA对荔枝体胚发生的促进作用一致。
同样也在对荔枝品种‘下番枝’体胚发生的研究中发现，在球形胚时期荔枝的细胞分裂素含量极低，需要添加额外的细胞分裂素，促进其体胚发生。本研究中，细胞分裂素类中的IP与cZ都对胡椒体细胞胚发生的作用不大，其中高含量的cZ可能与非胚性愈伤组织产生有关，这与对荔枝品种‘下番枝’体胚发生的研究结果不一致。或许胡椒体细胞胚发生不需要额外细胞分裂素。
JA与SA同为抗逆性植物激素[16-17]，但其中尚无JA在体细胞胚发生中作用的研究报道。在对西洋参[18]、胡萝卜[19]与苏铁[20]的体细胞胚发生研究中发现，通过添加适合浓度的外源SA，可以促进其体胚发生。在本研究中，SA对胡椒胚性愈伤组织产生与体细胞胚发生都有关，这与西洋参、胡萝卜与苏铁的体细胞胚发生相关研究结果一致。
ABA在胡椒胚性愈伤组织开始分化成体细胞胚时期含量最高，可能与这一时期植物细胞发生重大变化有关。在对橡胶花药[8]的不同类型愈伤组织中激素变化的研究中发现ABA在非胚性愈伤组织中含量最高，畸形胚中最低。而在本研究中，ABA在胡椒非胚性愈伤组织中含量很高，但在体细胞胚开始发生时含量最高，这与橡胶花药不同类型愈伤组织中激素变化的研究结果相似。
GA3是广泛分布于植物的一类重要生长调节剂，参与种子萌发，幼苗生长发育、果实成熟发育等重要的生理过程[21-22]。在大多数植物的体细胞胚发生研究中认为高含量的GA3对体细胞胚发生具有负作用[23]。GA3在胡椒不同时期体细胞胚中，无体细胞胚的GA3含量整体高于有体细胞胚的GA3含量，且GA3与ABA含量上升负相关，而ABA对胡椒体细胞胚发生有正相关，因此GA3可能对体细胞胚发生具有抑制作用。
通过本实验结果发现，植物内源激素与胡椒体细胞胚发生密切相关，且不同激素对胡椒体细胞胚发生作用不同。其中IAA与多数5种激素相关性强且含量变化显著，可能对胡椒体细胞胚发生的作用最明显，另外，SA与ABA在胡椒不同时期体细胞胚中含量水平都较高，而GA3、ME-JA与cZ只出现在胡椒愈伤组织時期。表明IAA、SA与ABA对胡椒体细胞胚发生密切相关，GA3、ME-JA与cZ对胡椒愈伤组织产生有作用。由此可见，胡椒体细胞胚不同时期中不同内源激素的比例，对胡椒体细胞胚发生具有特定的调控作用。
3.2 胡椒体细胞胚发生条件对内源激素变化的影响
植物生长发育与内源激素密切相关，而内源激素变化易受外界添加物、光照光强、胁迫条件等因素影响[24-25]。灵发素（LFS）对半夏体细胞胚发生和发育过程中内源激素IAA、ZR、ABA和GA3的调控起着重要作用[26]。在光、暗处理及不同浓度毒莠定（PIC）下对牡丹体细胞胚发生的内源激素影响研究中发现，光/暗12 h/12 h、PIC 4.0 mg/L的条件下对胚性愈伤组织产生有促进作用，并且球形胚提前出现，其中IAA含量远高于对照，且ABA/IAA和ABA/GA3均呈上升趋势[27]。在笔者前期研究发现，诱导胡椒胚性愈伤组织与体细胞胚较适宜的条件是无激素与暗培养，在体细胞胚开始发生后，再转移到光培养中才能进一步发育分化成苗。这与本研究中，胚性愈伤组织的内源激素中普遍含量都较低和体细胞胚发生与发育中部分激素水平升高的现象相对应。而根据本研究结果，光照培养后， IAA、SA与ABA含量的上升可能对胡椒体细胞胚发生具有促进作用，但仍需要研究验证。今后应进一步明确内源激素在胡椒体细胞胚发生中的作用机制，为探索激素调控胡椒体细胞胚发生提供试验基础。
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责任编辑：白 净
关键词：胡椒;愈伤组织;体细胞胚;内源激素
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JI Xunzhi1，2，3，4， HU Lisong1，2，3，4， QIN Xiaowei1，2，3，4， YANG Yiqiu1，5， FAN Rui1，2，3，4， HAO Chaoyun1，2，3，4*
1. Spice and Beverage Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Wanning， Hainan 571533， China; 2. Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of Spice and Beverage Crops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Wanning， Hainan 571533， China; 3. Hainan Provincial Key Laboratory of Genetic Improvement and Quality Regulation for Tropical Spice and Beverage Crops， Wanning， Hainan 571533， China; 4. Hainan Sim Soonliang academician workstation， Wanning， Hainan 571533， China; 5. College of Tropical Crop， Yunnan Agricultural University， Pu’er， Yunnan 665000， China
Abstract： In order to investigate the changes of endogenous hormones during different stages of somatic embryogenesis of P. nigrum， the endogenous hormones in five different development processes were detected at non-embryonic callus stage （Y）， embryonic callus stage （P）， mixed stage of embryonic callus and somatic embryo （H）， somatic embryo stage （T） and stage of somatic embryo proliferation （Z） by the LC-MS/MS technique. The content of indole-3-acetic acid （IAA） decreased gradually in the period of H， T and Z during the process of pepper somatic embryogenesis. The content of indole-3-butyric acid （IBA） was the highest in the period of Y and the lowest in the period of P， and the content of IBA was basically unchanged in the period of H， T and Z. Indole-3- Formic acid （ICA） content was the highest in the period of H， and ICA only existed at callus stage. Isopentenyladenine （IP） content was the highest at H， and was the lowest at P and close to zero at T and Z. Zeatin （cZ） content was the highest at Y， and cZ content was close to zero at other stages. Methyl jasmonate （ME-JA） only existed at Y and P， and former content was higher than latter content. Jasmonic acid （JA） content was the highest at Z， JA content was the lowest at P and increased gradually at other stages. Salicylic acid （SA） content was the highest at H， and was the lowest at Y and increased after decreased at other stages. Abscisic acid （ABA） content was the highest at H， and was the lowest at P and unchanged basically at T and Z. Gibberellins （GAS） mainly existed at Y and P， the levels were low at H， T， and Z. Therefore， IAA， SA and ABA may be strongly correlated with somatic embryogenesis， while cZ， ME-JA and GAS may be strongly correlatws with callus production. Keywords： Piper nigrum L.; callus; somatic embryogenesis; endogenous hormones
DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.04.013
胡椒（Piper nigrum L.）为多年生热带攀援藤本植物，果实具有辛辣香气，是世界最重要的香辛料作物，也是人们喜爱的调味品[1-2]。目前，我国以‘热引1号’胡椒为主栽品种，种苗来源一直以主蔓插条培育为主[3-4]。此法具有能够稳定保持种苗优良性状、后代发病率低等优点，但对其母株选择、苗圃规划、种苗培育环境与日常管理有较高要求，并且易受天气和人为因素的影响，成本高、周期长，无法满足产业发展对于大量优质种苗的需求。植物组织培养技术是一种无性繁殖方式，通过体细胞胚发生进行植株再生，能够极大地保留品种的优良性状和提高种苗的繁育效率，因此，組织培养技术对于胡椒种苗繁育具有重要的实用价值。
植物激素在调控细胞分化和生长方面具有重要作用，并在体细胞胚发生与发育方面起着调节作用[5]。目前，针对植物体细胞胚发生过程中内源激素研究主要集中于龙眼[6]、荔枝[7]与橡胶[8]等热带经济作物。然而，不同植物品种的不同部位体细胞胚发生所需最佳培养条件各有不同，内源激素种类与浓度是影响体细胞胚发生的重要因素。本研究拟以‘热引1号’胡椒为研究对象，在胡椒体细胞胚发生过程中的非胚性愈伤组织、胚性愈伤组织、愈伤组织与体细胞胚混合物、体细胞胚与体细胞胚增殖5个时期，研究不同时期胚性培养物的内源激素种类和含量及与体细胞胚发生的关系，以期为进一步完善胡椒体细胞胚发生提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
挑取‘热引1号’胡椒外种皮，在MS培养基上25 ℃下暗培养60 d，获得非胚性愈伤组织及培养相同时间获得的胚性愈伤组织（图1）。A为胡椒外种皮，试验材料胡椒5个时期样品分别标记如下：B为非胚性愈伤组织（Y）;C为胚性愈伤组织（P）;D为胚性愈伤组织与体细胞胚混合物（H）;E为体细胞胚（T）;F为体细胞胚增殖（Z）。对P光培养40 d，对H进行取样;继续对P光培养90 d，再次挑取完全的T;继续对T光培养30 d，再次进行取样。每次取样后，立即对样品用液氮速冻后进行?80 ℃的低温保存。实验重复3次。
1.2 方法
1.2.1 激素标准曲线的制作 参照Malgorzata等[9]的方法，称取激素标准品，用甲醇（色谱纯）充分溶解后，取该溶液稀释后配制成母液，再进行等度稀释，以峰面积为纵坐标，标准品浓度为横坐标制作标准曲线。
1.2.2 粗提液的制备 参照?imura等[10]的方法，称取材料50 mg，重复3次，加入1 mL的激素提取剂进行研磨，取上清液，重复提取3次，进行冷冻高压冻干后，加入1 mL甲醇（色谱纯）重新溶解，用0.45 μm微孔滤膜过滤后，低温保存，备用。
1.2.3 LC-MS/MS检测条件 （1）色谱条件。参照Floková等[11]的方法，色谱柱为Waters色谱柱（Acquity Uplc Hss T3 C18 1.8 ?m，2.1 mm×100 mm）。流动相：超纯水与乙腈（色谱纯）的体积比按时间进行梯度洗脱，流速0.35 mL/min，时间0～8 min、8～9 min、9～12 min的水∶乙腈流动相体积比分别为95∶5、5∶95、95∶5。
（2）质谱条件。参照Cui等[12]与Xiao等[13]的方法，利用标准品确定激素标准品的母离子与子离子最佳响应条件，并记录最佳锥孔电压和碰撞电压。每个离子对根据优化的去簇电压（declustering potential， DP）和碰撞能（collision energy， CE）进行扫描检测（表1，图2）。样本中激素的含量采用以下公式计算：
样本中激素含量（ng/g）=BCD/1000。
式中，B为样本中激素积分峰面积比值代入标准曲线得到的浓度值（ng/mL）;C为复溶时所用溶液的体积（μL）;D为称取的样本质量（g）。
1.3 数据处理
用Analyst 1.6.1软件处理液相LC-MS/MS联用分析得到的质谱图数据，将检测到的所有样本激素的积分峰面积比值代入标准曲线线性方程进行计算，并代入计算公式，最终得到实际样本中
激素的绝对含量数据，并采用IBM SPSS Statistics 25.0与GraphPad Prism 8.0软件对数据进行ANOVA及相关性分析，生成图表并分析。
2 结果与分析
2.1 不同时期胡椒体细胞胚生长素类（Auxin）含量变化
如图3所示，在对不同发育时期吲哚-3-乙酸（IAA）进行测定发现，IAA含量在H时期最高达6.21 ng/g，在P时期IAA含量最低为0 ng/g。不过，在体细胞胚发生过程中的H、T与Z时期的IAA含量都显著高于不分化的Y时期，但在体细胞胚发生过程中，IAA含量逐渐降低。
在对不同发育时期吲哚-3-丁酸（IBA）进行测定发现，IBA含量在Y时期最高达1.15 ng/g，在P时期IBA含量最低为0.08 ng/g。在体细胞胚发生过程中的H、T与Z时期的IBA含量基本不变，但三者的IBA含量都显著低于Y时期。
在对不同发育时期吲哚-3-甲酸（ICA）进行测定发现，ICA含量在H时期最高达1.58 ng/g，在T和Z时期ICA含量最低为0 ng/g。另外ICA只存在含有愈伤组织的Y、P与H时期。 在同一时期的生长素类激素比较中，Y时期中的IBA含量最高;在P时期中的ICA含量最高;在体细胞胚发生的H、T与Z时期中的IAA含量最高。由相关结果分析可知，IAA可能与胡椒愈伤组织开始分化体细胞胚有关，而高含量的IBA可能与胡椒愈伤组织不分化有关。
不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
Different small letters represent extremely significant difference （P<0.05）.
2.2 不同时期胡椒体细胞胚细胞分裂素类（CTK）含量变化
如图4所示，在对不同发育时期异戊烯腺嘌呤（IP）进行测定发现，IP含量在H时期最高达6.21 ng/g，在P时期IP含量最低为0.01 ng/g。在体细胞胚发生后的T与Z时期的IP含量降低到0.03 ng/g，显著低于不分化的Y时期。
在对不同发育时期顺式玉米素（cZ）进行测定发现，cZ含量在Y时期最高达1.33 ng/g，其他时期的cZ含量都较低，为0.01 ng/g左右。
在同一時期的细胞分裂素类激素比较中，Y时期中的cZ含量最高;在P时期中的IP与cZ含量都接近于零;在体细胞胚发生的H、T与Z时期中的IP含量较高。由相关结果分析可知，cZ的存在可能与胡椒非胚性愈伤组织不分化有关，IP可能与胡椒体细胞胚发育有关。
不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
Different small letters represent extremely significant difference （P<0.05）.
2.3 不同时期胡椒体细胞胚茉莉酸类（JA）含量变化
如图5所示，在对不同发育时期茉莉酸甲酯（ME-JA）进行测定发现，ME-JA含量在Y时期最高达0.23 ng/g，在体细胞胚开始发生的H、T与Z时期的ME-JA含量降低到0 ng/g，但在P时期ME-JA含量也有0.19 ng/g。ME-JA只存在还未开始分化的愈伤组织里。
在对不同发育时期茉莉酸（JA）进行测定发现，JA含量在Z时期最高达2.56 ng/g，在P时期JA含量最低为0 ng/g。在体细胞胚发生过程中的H、T与Z时期的JA含量逐渐升高，但三者的JA含量都显著低于Y时期。
在同一时期的茉莉酸类激素比较中，Y时期中的JA含量最高;在P时期中的ME-JA含量较高;在体细胞胚发生的H、T与Z时期中的JA含量较高。由相关结果分析可知，JA可能与胡椒体细胞胚分化与发育有关，而ME-JA可能只与胡椒愈伤组织形成有关。
不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
Different small letters represent extremely significant difference （P<0.05）.
2.4 不同时期胡椒体细胞胚水杨酸（SA）与脱落酸（ABA）含量变化
如图6所示，在对不同发育时期水杨酸（SA）进行测定发现，SA含量在H时期最高达48.10 ng/g，在Y时期SA含量最低为15.27 ng/g。在体细胞胚开始发生的H、T与Z时期的SA含量先降后升，由T时期的18.13 ng/g升到Z时期的25.17 ng/g，且在P时期的SA含量也有19.17 ng/g。
在对不同发育时期脱落酸（ABA）进行测定发现，ABA含量在H时期最高达17.47 ng/g，在P时期ABA含量最低为0.17 ng/g。在体细胞胚发生后的T与Z时期的ABA含量基本不变，保持在5.80 ng/g，但二者的ABA含量都显著低于Y时期的11.03 ng/g。由相关结果分析可知，SA与ABA含量的升高可能与胡椒愈伤组织开始分化体细胞胚有关，但SA与ABA可能不利于胡椒体细胞胚进一步发育。
2.5 不同时期胡椒体细胞胚GAS类含量变化
如图7所示，在对不同发育时期赤霉素类（GAS）进行测定发现，GA3含量只存在P时期达0.26 ng/g，其他时候不含GA3含量。GA9在Y时期达到最高值0.31 ng/g，并显著高于体细胞胚开始发生的H与T时期含量。GA15在Y时期达
不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
Different small letters represent extremely significant difference （P<0.05）.
不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
Different small letters represent extremely significant difference （P<0.05）.
到最高值0.40 ng/g，在P时期含量最低为0.05 ng/g，在体细胞胚发生的H、T、Z时期呈先升后降，但各时期的GA15含量差异不显著。GA20存在Y、H、T与Z时期，其中H时期达最高值0.45 ng/g，其余时期含量都在0.35 ng/g左右，且各时期的GA20含量差异不显著。由相关结果分析可知，不同的GAS对胡椒体细胞胚发生影响不同，GA3可能与胡椒胚性愈伤组织形成有关，而高含量的GA9可能与胡椒非胚性愈伤组织形成有关，GA15与GA20可能在胡椒体细胞胚发生中起到辅助作用。
2.6 不同时期胡椒体细胞胚中不同内源激素含量的相关性分析
由表2可知，IAA与ICA、IP、SA、ABA均呈极显著正相关性（r = 0.815**，r = 0.948**，r = 0.932**，r = 0.809**），与ME-JA有显著负相关性（r =?0.537*）;IBA与cZ、ME-JA均有极显著正相关性（r = 0.983**，r = 0.659**）;ICA与IP、SA、ABA有极显著正相关性（r =0.905**，r = 0.749**，r = 0.865**）;IP与SA、ABA有极显著正相关性（r = 0.916**，r = 0.907**）;cZ与ME-JA有极显著正相关性（r =0.708**）;ME-JA与SA有显著正相关（r = 0.542*）;SA与ABA有极显著正相关性（r = 0.702**）;GA3与ABA有极显著负相关性（r = ?0.670**），与ME-JA有显著负相关性（r = ?0.638*）;GA9与IBA、cZ有极显著正相关性（r = 0.945**，r = 0.945**），与JA有显著正相关性（r = 0.614*）;GA15与IBA、GA9有显著正相关性（r = 0.514*，r = 0.556**）。由相关系数分析得知，IAA、ICA、IP、SA与ABA可能对胡椒体细胞胚发生的作用相同且密切相关，ME-JA、IBA与cZ的作用与IAA等相反，GAS中的GA3与GA9、GA15的作用不一致。 3 讨论
3.1 胡椒不同时期体细胞胚中的内源激素变化
植物激素对植物细胞的增殖分裂、结构分化与生命代谢等方面都具有重要的调节作用，而植
物体细胞胚发生与内源激素含量的变化密切相关，各种激素对植物体细胞胚胎发生有不同的影响[14-15]。在对龙眼体细胞胚发生过程中内源激素变化的研究中发现，IAA在胚性愈伤组织中含量大于非胚性愈伤组织，并在球形胚时期到达高峰[6]。在本研究中，通过对胡椒体细胞胚发生不同时期的内源激素研究发现，生长素类激素中，IAA可
能与胡椒体细胞胚的发生与发育有关，而IBA与ICA的高含量可能与抑制胡椒体细胞胚发生有关，与龙眼体细胞胚发生的研究结果相似。另外在对荔枝品种‘下番枝’体细胞胚发生过程中内源激素的研究中发现IAA含量上升对荔枝早期体胚发生具有促进作用[7]，而本研究结果与其IAA对荔枝体胚发生的促进作用一致。
同样也在对荔枝品种‘下番枝’体胚发生的研究中发现，在球形胚时期荔枝的细胞分裂素含量极低，需要添加额外的细胞分裂素，促进其体胚发生。本研究中，细胞分裂素类中的IP与cZ都对胡椒体细胞胚发生的作用不大，其中高含量的cZ可能与非胚性愈伤组织产生有关，这与对荔枝品种‘下番枝’体胚发生的研究结果不一致。或许胡椒体细胞胚发生不需要额外细胞分裂素。
JA与SA同为抗逆性植物激素[16-17]，但其中尚无JA在体细胞胚发生中作用的研究报道。在对西洋参[18]、胡萝卜[19]与苏铁[20]的体细胞胚发生研究中发现，通过添加适合浓度的外源SA，可以促进其体胚发生。在本研究中，SA对胡椒胚性愈伤组织产生与体细胞胚发生都有关，这与西洋参、胡萝卜与苏铁的体细胞胚发生相关研究结果一致。
ABA在胡椒胚性愈伤组织开始分化成体细胞胚时期含量最高，可能与这一时期植物细胞发生重大变化有关。在对橡胶花药[8]的不同类型愈伤组织中激素变化的研究中发现ABA在非胚性愈伤组织中含量最高，畸形胚中最低。而在本研究中，ABA在胡椒非胚性愈伤组织中含量很高，但在体细胞胚开始发生时含量最高，这与橡胶花药不同类型愈伤组织中激素变化的研究结果相似。
GA3是广泛分布于植物的一类重要生长调节剂，参与种子萌发，幼苗生长发育、果实成熟发育等重要的生理过程[21-22]。在大多数植物的体细胞胚发生研究中认为高含量的GA3对体细胞胚发生具有负作用[23]。GA3在胡椒不同时期体细胞胚中，无体细胞胚的GA3含量整体高于有体细胞胚的GA3含量，且GA3与ABA含量上升负相关，而ABA对胡椒体细胞胚发生有正相关，因此GA3可能对体细胞胚发生具有抑制作用。
通过本实验结果发现，植物内源激素与胡椒体细胞胚发生密切相关，且不同激素对胡椒体细胞胚发生作用不同。其中IAA与多数5种激素相关性强且含量变化显著，可能对胡椒体细胞胚发生的作用最明显，另外，SA与ABA在胡椒不同时期体细胞胚中含量水平都较高，而GA3、ME-JA与cZ只出现在胡椒愈伤组织時期。表明IAA、SA与ABA对胡椒体细胞胚发生密切相关，GA3、ME-JA与cZ对胡椒愈伤组织产生有作用。由此可见，胡椒体细胞胚不同时期中不同内源激素的比例，对胡椒体细胞胚发生具有特定的调控作用。
3.2 胡椒体细胞胚发生条件对内源激素变化的影响
植物生长发育与内源激素密切相关，而内源激素变化易受外界添加物、光照光强、胁迫条件等因素影响[24-25]。灵发素（LFS）对半夏体细胞胚发生和发育过程中内源激素IAA、ZR、ABA和GA3的调控起着重要作用[26]。在光、暗处理及不同浓度毒莠定（PIC）下对牡丹体细胞胚发生的内源激素影响研究中发现，光/暗12 h/12 h、PIC 4.0 mg/L的条件下对胚性愈伤组织产生有促进作用，并且球形胚提前出现，其中IAA含量远高于对照，且ABA/IAA和ABA/GA3均呈上升趋势[27]。在笔者前期研究发现，诱导胡椒胚性愈伤组织与体细胞胚较适宜的条件是无激素与暗培养，在体细胞胚开始发生后，再转移到光培养中才能进一步发育分化成苗。这与本研究中，胚性愈伤组织的内源激素中普遍含量都较低和体细胞胚发生与发育中部分激素水平升高的现象相对应。而根据本研究结果，光照培养后， IAA、SA与ABA含量的上升可能对胡椒体细胞胚发生具有促进作用，但仍需要研究验证。今后应进一步明确内源激素在胡椒体细胞胚发生中的作用机制，为探索激素调控胡椒体细胞胚发生提供试验基础。
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责任编辑：白 净