采集遵义市15年长期施肥定位试验的土壤，包括撂荒地（对照）、烤烟连作—单施化肥、烤烟连作—化肥有机肥配施、烤烟玉米轮作—单施化肥和烤烟玉米轮作—化肥有机肥配施等处理，通过土壤悬浊液与培养液混合培养技术、微生物高通量测序及常规分析，研究长期施肥对土壤无机磷活化的影响。结果表明，烤烟玉米轮作、施用有机肥和撂荒地的土壤可培养微生物（细菌、真菌、放线菌和无机磷细菌）数量增多，种群多样性增加，说明土壤生态环境改善。将土壤悬浊液接种至微生物培养液中，培养期间混合液中的有效磷含量以烤烟玉米轮作高于烤烟连作，化肥有机肥配施和撂荒地高于单施化肥，其中以烤烟玉米轮作—化肥有机肥配施最高，烤烟连作—单施化肥最低，说明合理种植和科学施肥有益于土壤无机磷的活化，在遵义烟区提倡烤烟玉米轮作—化肥有机肥配施很有必要。在混合液中，氢离子与溶解钙磷、有机酸与溶解铁磷和铝磷显著相关。与溶磷微生物的纯培养技术相比，土壤悬浊液培养既能反映微生物的溶磷特征，又更接近土壤微生物菌群复杂的溶磷状况。在供试土壤微生物中，存在柠檬酸合酶、蛋白葡萄糖脱氢酶和苹果酸合酶等的合成通路，处理间的差异可从分子生物学角度解释合理轮作和化肥有机肥配施促进土壤无机磷活化的原因。