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摘要：【目的】分析廣西百色云耳野生菌株的遗传多样性，为其种质资源的保护及开发利用提供参考。【方法】从广西百色地区采集23个云耳野生菌株，进行人工栽培，期间观察测定其农艺性状；采用酯酶同工酶技术分析不同云耳菌株的酯酶同工酶酶谱多态性，并进行聚类分析。【结果】在23个云耳野生菌株中，子实体朵形为单生的菌株有16个、簇生的7个；耳片边缘平滑的菌株13个，波浪状的菌株10个；耳片背面筋道脉纹明显或较明显的有15个，不明显或无脉纹的有8个；耳片颜色为浅黄褐色的菌株4个，黄褐色的8个，黑褐色的11个；耳片大小（长×宽）为30.1～51.6 mm×20.5～41.7 mm，厚度0.95～1.44 mm，表明百色云耳的形态特征具有丰富的多样性；原基形成时间26～59 d，杂菌感染率0～51.1%，耳片干湿比10.1～14.1，第一潮产量8.2%～50.5%，表明不同菌株的原基形成时间、抗杂性、干湿比和产量等方面也具有丰富的多样性。23个云耳野生菌株共检测到19条谱带，有18种谱带类型，谱带的迁移率（Rf）为16.6～88.6，分布频率为4.3%～100.0%，其中有3条带是百色云耳酯酶同工酶的特征谱带。23个云耳野生菌株的遗传相似系数为0.68～1.00，在遗传相似系数为0.68时，可分为两大类群，其中大部分菌株的聚类结果与其地理位置吻合。【结论】广西百色云耳野生菌株具有丰富的遗传多样性，蕴含着较多的优异遗传性状，具有较大的开发利用潜力。
关键词： 百色云耳；野生菌株；遗传多样性；农艺性状；酯酶同工酶
中图分类号： S646.603 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）06-1061-07
Abstract：【Objective】The genetic diversity of Baise Auricularia auricular wild strains in Guangxi was analyzed， in order to provide reference for protection， exploitation and utilization of the resources of Baise A. auricular. 【Method】Twenty-three A. auricular wild strains were collected from Baise in Guangxi and artificially cultivated. During this period， their agronomic characters were observed and determined. The polymorphism of esterase isozyme bands in different A. auricular strains was analyzed by using esterase isozyme technology， and cluster analysis was also conducted. 【Result】Among the 23 wild strains， there were 16 strains with the growth type of individual fruit body， 7 strains with clustered fruit body；13 stains had smooth margin and 10 strains had wavy margin； at the back of A. auricular， 15 strains had ob-vious or relatively obvious veins， and 8 strains had no veins or no obvious veins； the surface color of 4 strains was fawn， 8 strains tawny， and 11 strains was black brown； the size of surface（length×width） were 30.1-51.6 mm×20.5-41.7 mm and the thickness was 0.95-1.44 mm. These results showed that the morphology characters of Baise A. auricular possessed high diversity. The germination time of primodium varied from 26 to 59 d， and contamination rate of other strains varied from 0 to 51.1%； dry-wet ration of surface varied from 10.1 to 14.1 and yield of first tide varied from 8.2% to 50.5%. These results showed that there were high diversity among different strains on germination time of primordium，anti-weed-moulds， dry-wet ratio and yields. There were 19 bands in total and 18 types of bands detected from the 23 wild strains. The mobility rate（Rf） of bands ranged from 16.6 to 88.6， and the distribution frequency ranged from 4.3% to 100.0%. Three of the bands were the characteristic bands in esterase isozyme bands of Baise A. auricular. The genetic similarity coefficients ranged from 0.68 to 1.00 among the 23 wild strains. The 23 wild strains could be divided into two groups at the similarity coefficient of 0.68. And the cluster analysis results of most strains were agreed with their geographical distribution. 【Conclusion】Baise A. auricular wild strains in Guangxi possesses high genetic diversity，implies many good genetic characters and has great potential for exploitation and utilization. Key words： Baise Auricularia auricular； wild strains； genetic diversity； agronomic characters； esterase isozyme
0 引言
【研究意义】云耳（Auricularia auricular）是我国南方地区对黑木耳的一种俗称，隶属于担子菌亚门异担子菌纲木耳目木耳科木耳属（戴玉成等，2010），在我国广泛分布，其产量仅次于香菇和平菇，为四大食用菌之一（中国食用菌协会，2013；冯小飞等，2016）。百色云耳是指自然分布于广西百色地区各县（区）的野生黑木耳，以田林县分布最广、产量最高、品质优良，曾多次在全国黑木耳质量评比中名列三甲，远销港澳及东南亚等地，是广西特有的黑木耳（农训学，2009；谢毅栋，2009）。百色云耳属于适合南亚热带植被地理条件生长的典型生态种群，也是我国黑木耳的一个重要生态类群（李发盛等，2008b；黄艳芳等，2012）。因此，开展百色云耳的遗传多样性研究对其种质鉴定、驯化栽培、资源保护及遗传育种具有重要意义。【前人研究进展】目前，种质资源的遗传多样性主要通过形态学标记、细胞学标记、生物化学标记和分子遗传标记等方法进行研究。有关黑木耳的遗传多样性研究已有较多报道。唐利华等（2007）通过酯酶同工酶分析对我国34个主栽的黑木耳菌株进行遗传多样性研究，结果表明其遗传背景差异不明显。陶梅等（2009）通过体细胞不亲和性反应和ITS序列分析对黑龙江省黑木耳栽培菌株进行亲缘关系研究，结果表明其亲缘关系较近，遗传多样性不丰富。Tang等（2010）分别采用ISSR和SRAP分子标记技术对黑龙江省黑木耳菌株的遗传多样性进行分析，结果表明其具有较丰富的遗传多样性。陶朋飞和许修宏（2011）应用ITS和SRAP分子标记技术分析黑龙江省野生黑木耳菌株的遗传多样性，结果表明其具有较丰富的遗传多样性。钱雪婷（2016）通过农艺学性状描述、酯酶同工酶分析试验、体细胞不亲和性反应和ITS序列分析对秦巴山区的45个黑木耳菌株的遗传多样性进行研究，结果发现其遗传多样性较丰富。有关百色云耳的研究报道，李发盛等（2008b）、黄艳芳等（2012）研究发现，百色云耳形态特征与东北主推的黑木耳品种存在明显差异；王灿琴等（2012）对5个百色云耳菌株的菌丝生长状况、子实体形态、出菇期和产量等性状进行比较分析，结果表明不同菌株的农艺性状存在明显差异。【本研究切入点】目前，针对百色云耳野生种群资源的研究仅限于形态学或农艺性状指标的观察及测定，涉及的菌株数量也很少，尚缺乏全面系统的研究，尤其鲜见有关百色云耳野生菌株遗传多样性的研究报道。【拟解决的关键问题】将农艺性状测定与酯酶同工酶分析试验相结合，对23个百色云耳野生菌株进行遗传多样性分析，以期挖掘百色云耳优良性状和优异基因，为其种质资源的保护和开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试百色云耳野生菌株共23个，其名称、采集时间和采集地见表1。N，N-亚甲双丙烯酰胺、α，β-乙酸萘酯、坚固蓝等主要试剂购自生工生物工程（上海）股份有限公司。主要仪器设备：电泳仪（DYCZ-24，北京市六一仪器厂）、恒温水浴锅（HH-W420，江苏省金坛市医疗仪器厂）、高速冷冻离心机（TGL-16G，上海安亭科学仪器厂）和摇床（QYC-211，上海福玛实验设备有限公司）等。
1. 2 农艺性状测定
于2016年10月～2017年3月采用袋料栽培方式进行云耳菌株的出耳试验。栽培袋料配方：阔叶树木屑78%，麦麸20%，石膏1%，石灰1%。按照任建平（2015）的方法进行栽培袋料配制、装袋、高压灭菌和接种，每个菌株制备菌包90袋。接种后的菌包置于28 ℃培养室培养，期间记录从接种至多数菌包开始形成原基所需的天数，即原基形成时间。菌丝满袋并有少量原基形成时，将菌包移至出菇棚，按照任建平（2015）的方法进行催耳芽和出耳管理。出耳期间，观察记录云耳的着生方式，统计菌包杂菌感染率。待云耳耳片充分舒展，耳基收缩，耳边内卷，腹凹面出现白色孢子粉后，采收第一潮云耳。采收时记录云耳子实体形态，并统计产量，产量按生物学效率计算，即生物学效率（%）=第一潮云耳鲜重（kg）/栽培袋料干重（kg）×100。同时测定每个菌株子实体的干湿比，干湿比=吸水完全的云耳鲜重（kg）/云耳干重（kg）。
1. 3 酯酶同工酶酶谱分析
将菌丝刚长满试管斜面的云耳菌株接种于装有PDA液体培养基的三角瓶中，于28 ℃摇床培养25 d，然后过滤菌丝，挤干水分。按照韦仕岩等（2014）的方法制备酯酶同工酶样品，并进行电泳、染色及酶谱分析。
1. 4 统计分析
基于上述酯酶同工酶的电泳数据，以NTSYS-PC计算不同菌株间遗传相似系数。采用不加权成对群算术平均法（UPGMA）进行云耳菌株的遗传相似性聚类分析，构建系统发育进化树。
2 结果与分析
2. 1 百色云耳野生菌株的农艺性状测定结果
2. 1. 1 形态特征 由表2可知，在23个百色云耳野生菌株中，子实体朵形为单生的有16个，簇生的有7个；耳片边缘平滑的有13个，波浪状的有10个；耳片背面筋道脉纹明显或较明显的有15个，不明显或无脉纹的有8个；耳片颜色浅黄褐色的有4个，黄褐色的有8个，黑褐色的有11个；耳片长度30.1～51.6 mm；耳片宽度20.5～41.7 mm；耳片厚度0.95～1.44 mm。其中，菌株TY011、TY012、TY013、TY026和TY051具有良好的子实体形态，单生，耳片边缘平滑，脉纹不明显，耳片也较大（长×宽>39.0 mm×28.0 mm，下同），但耳片较薄（厚度<1.00 mm，下同）；菌株TY031也具有良好的子实体形态，多为单生，耳片边缘平滑，脉纹不明显，耳片厚（1.25 mm）但较小（仅32.8 mm×22.9 mm）；菌株TY041、YE1、YE2、YE3和YE6的耳片较大且厚（厚度>1.00 mm，下同），但耳片邊缘呈波浪状，部分菌株脉纹较多；菌株TY052.1和TY052.2的耳片较大，但子实体其他形态均较差；菌株TY022、TY023、TY024、TY053、TY054、TY055、TY061、TY062和TY063的耳片均较厚，尤其是菌株TY024的耳片厚度为1.44 mm，但子实体其他形态均较差。综上所述，百色云耳野生菌的形态特征具有丰富的多样性，且含有较多优良的外观性状。 2. 1. 2 栽培性状 由表3可知，23个百色云耳野生菌株中，菌株TY011、TY012、TY023、TY24、TY026、TY041、TY062、YE1和YE3为早熟型品种，原基形成时间仅26～32 d；菌株TY031、TY051、TY061、TY013、YE2和YE6为中熟型品种，原基形成时间为36～45 d；其余菌株均为晚熟型品种，原基形成时间为48～59 d。菌株TY013、TY024、TY026、TY041、TY063、YE1、YE2、YE3和YE6有较高的抗杂菌能力，杂菌感染率均低于8.0%；菌株TY012、TY022、TY031、TY042、TY053、TY054和TY062的抗杂菌能力较差，杂菌感染率均高于22.0%，最高达51.1%。菌株TY026、TY041、TY042、YE1、YE2、YE3和YE6的产量均较高，第一潮产量达41.7%～50.5%；菌株TY022、TY023、TY031、TY053、TY054和TY062的产量较低，第一潮产量仅8.2%～15.3%。不同百色云耳菌株耳片的干湿比为10.1～14.1，表明不同菌株间耳片的干湿比存在明显差异。综上所述，百色云耳野生菌的原基形成时间、抗杂能力、产量和子实体干湿比等栽培学性状多样性丰富，可满足不同栽培需求，并蕴含较多的优良栽培性状。
2. 2 百色云耳野生菌株的酯酶同工酶酶谱分析结果
对23个云耳野生菌株的酯酶同工酶样品进行电泳，酶谱如图1所示。根据酶谱进行酶带分布特征和迁移率分析，结果如图2所示。由图1和图2可知，从23个百色云耳菌株共检测出19条谱带，有18种谱带类型，各菌株的谱带数4～10条，各谱带的迁移率（Rf）为16.6～88.6，分布频率为4.3%～100.0%，其中带6和带8的分布频率均达100.0%，为百色云耳酯酶同工酶的特征谱带，带7的分布频率为82.6%，也可能是百色云耳的特征谱带。可见，百色云耳野生菌的酯酶同工酶酶谱多态性非常丰富。
2. 3 聚类分析结果
利用NTSYS-PC对23个百色云耳野生菌株的酯酶同工酶谱带数据进行聚类分析，结果如图3所示。23个百色云耳野生菌株的遗传相似系数为0.68～1.00，遗传差异变化较大，说明百色云耳菌株的遗传背景较丰富。在遗传相似系数为0.68时，可将23个菌株分为两大类：第一类包括菌株YE1、TY011、TY012、TY055、YE3、TY013和TY026共7个菌株；第二类包括菌株YE2、YE6、TY022、TY042、TY051、TY023、TY024、TY031、TY041、TY053、TY054、TY061、TY062、TY063、TY052.1和TY052.2共16个菌株。结合菌株的农艺性状进行分析，结果表明两大类的菌株在耳片颜色上存在差异。其中，第一类菌株的耳片颜色较浅，呈浅黄褐色至黄褐色，第二类菌株的耳片颜色较深，呈黄褐色至黑褐色；其他农艺性状与聚类结果间未见相吻合的规律。第一类的7个菌株中，菌株TY011、TY012和TY013均来自田林县定安镇，第二类的16个菌株中，菌株TY041、TY042等11个菌株来自田林县八渡乡，说明同一来源地的菌株遗传背景差异较小，亲缘关系较近的可能性较大。不同菌株还可能存在同物异名现象，第一类中，菌株TY011与TY012的遗传相似系数为1.00，且与菌株YE1的遗传相似系数也达0.95，表明这3个菌株存在同物异名的可能性很大；第二类中，菌株TY023与TY024、菌株TY062与TY063、菌株TY052.1与TY052.2及菌株TY053、TY054、TY061与TY041间的遗传相似系数均大于0.95，均可能存在同物异名的现象。
3 讨论
种质资源遗传多样性是农艺性状、细胞学、生物化学及分子遗传标记等方面多样性的综合体现（季维智和宿兵，1999；钱雪婷，2016）。对于黑木耳而言，子实体朵形、腹背面脉纹（皱褶）、耳片颜色、大小和厚度等形态特征及干湿比、原基形成时间、抗杂性和产量等栽培性状是最常用的农艺性状指标（陈影等，2014）。本研究的23个百色云耳菌株在子实体朵形、耳片背面脉纹、颜色和大小等形态特征上具有丰富的多样性。我国秦巴山区和东北地区的黑木耳的农艺性状也呈较高的多样性（马庆芳等，2007；钱雪婷，2016）。黄艳芳等（2012）研究认为，百色云耳以单生为主、簇生极少，颜色棕褐色，无脉纹。该结论未体现百色云耳外观形态性状的多样性，可能与其观测的菌株数量少（僅6个）有关。王灿琴等（2012）分离得到的5个百色云耳菌株在形态特征、产量和抗杂性等方面存在明显差异。本研究结果显示，23个百色云耳野生菌株的原基形成时间为26～59 d，可分为早熟型、中早熟型和晚熟型3种类型，与马庆芳等（2007）根据出耳周期对东北地区黑木耳的划分结果基本一致；不同菌株的杂菌感染率0～51.1%，产量8.2%～50.5%，说明抗杂性和产量差异明显。可见，百色云耳菌株在原基形成时间、抗杂性和产量等栽培性状上也具有丰富的多样性。
丰富的农艺性状多样性是挖掘云耳优良性状和品种选育的物质基础。很多科研人员均是从农艺性状丰富多样的黑木耳野生种质资源中筛选培育出生长旺盛、抗杂性强、产量高的优良菌株（马庆芳等，2007；钱雪婷，2016；翟玉，2016）。本研究结果表明，百色云耳野生资源蕴含着较多优良性状，如菌株TY011、TY012和TY031等的子实体形态良好，菌株TY024等的耳片较厚，菌株TY013、TY024和TY026等的抗杂性强，菌株TY026、YE2和YE6等产量高，具有较大的开发利用潜力。李发盛等（2008a，2009）从百色云耳野生资源中筛选驯化出一株适合桑枝栽培的高产菌株百云6号；陈雪凤等（2016a，2018）从百色云耳野生资源中分别筛选出富集钙和铁能力强的菌株及耐高温的菌株。可见，百色云耳野生资源优异性状基因的挖掘潜力巨大。 酯酶同工酶作为基因表达的产物，其谱带的差异间接代表了DNA分子变异，因此，酯酶同工酶技术是研究生物群体遗传差异的重要手段之一，现已广泛应用于木耳等食用菌的鉴别及遗传多样性分析（边银丙等，2000；唐利华等，2007；韦仕岩等，2014；陈雪凤等，2016b）。本研究采用酯酶同工酶技术对23个百色云耳野生菌株进行遗传多样性分析，结果显示从23个菌株中共检测出19条谱带，有18种谱带类型，表明百色云耳野生菌株的酯酶同工酶多态性较高，遗传多样性丰富；其遗传相似系数为0.68～1.00，说明23个菌株间发生明显遗传变异，亲缘关系较近。同样采用酯酶同工酶技术，翟玉（2016）研究发现，东北地区和云南地区的33个黑木耳菌株的遺传相似系数为0.52～1.00；唐利华等（2007）研究发现，来自国内不同地区的34个黑木耳栽培菌株的遗传相似系数为0.14～1.00。与上述研究结果相比，本研究中百色云耳菌株间的遗传相似系数较高，其原因可能是供试的百色云耳仅采集于田林县或近邻县，地理范围太狭窄，遗传背景相似。
聚类分析是基于亲缘关系进行归类。翟玉（2016）研究表明，来自云南和东北地区的33个黑木耳的聚类结果与其地理位置高度吻合。本研究将23个百色云耳野生菌株划分为两大类，第一类有7个菌株，来自定安镇的3个菌株均归在该类；第二类有16个菌株，来自八渡乡的12个菌株中有11个菌株归在该类，表明来自地理位置相近的云耳菌株遗传背景差异越小，亲缘关系较近的可能性较大。但唐利华等（2007）研究发现，来自国内34个黑木耳栽培菌株聚类结果与其地理位置不吻合，可能与栽培菌株在我国各地穿插引种频繁有关。本研究还发现，个别来自不同乡（镇）的百色云耳野生菌株间亲缘关系也很近，如田林县浪平乡的菌株YE1和田林县定安镇的TY011和TY012遗传相似系数达0.95，可能是不同地域间相互引种栽培造成。此外，本研究结果显示23个百色云耳野生菌株的聚类结果与其耳片颜色具有较好的相关性，其中第一类菌株耳片颜色偏浅，呈浅黄褐色至黄褐色，第二类菌株的耳片颜色较深，呈黄褐色至黑褐色，由于两个类群中均有黄褐色的菌株，且颜色深浅受栽培环境的影响较大，因此，仅用颜色指标作为划分百色云耳亲缘关系的依据并不科学。本研究供试的百色云耳野生菌株多数来自百色田林县，无法全面、准确地反映百色云耳野生菌株的遗传多样性。在今后的研究中，应扩大采集菌株的地理范围，收集更多的菌株，并将多种技术相结合对百色云耳野生菌株开展系统地研究，为其种群资源的保护和开发利用提供参考。
4 结论
百色云耳野生菌株具有丰富的遗传多样性，蕴含着较多的优异遗传性状，具有较大的开发利用潜力。
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（责任编辑 陈 燕）
关键词： 百色云耳；野生菌株；遗传多样性；农艺性状；酯酶同工酶
中图分类号： S646.603 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）06-1061-07
Abstract：【Objective】The genetic diversity of Baise Auricularia auricular wild strains in Guangxi was analyzed， in order to provide reference for protection， exploitation and utilization of the resources of Baise A. auricular. 【Method】Twenty-three A. auricular wild strains were collected from Baise in Guangxi and artificially cultivated. During this period， their agronomic characters were observed and determined. The polymorphism of esterase isozyme bands in different A. auricular strains was analyzed by using esterase isozyme technology， and cluster analysis was also conducted. 【Result】Among the 23 wild strains， there were 16 strains with the growth type of individual fruit body， 7 strains with clustered fruit body；13 stains had smooth margin and 10 strains had wavy margin； at the back of A. auricular， 15 strains had ob-vious or relatively obvious veins， and 8 strains had no veins or no obvious veins； the surface color of 4 strains was fawn， 8 strains tawny， and 11 strains was black brown； the size of surface（length×width） were 30.1-51.6 mm×20.5-41.7 mm and the thickness was 0.95-1.44 mm. These results showed that the morphology characters of Baise A. auricular possessed high diversity. The germination time of primodium varied from 26 to 59 d， and contamination rate of other strains varied from 0 to 51.1%； dry-wet ration of surface varied from 10.1 to 14.1 and yield of first tide varied from 8.2% to 50.5%. These results showed that there were high diversity among different strains on germination time of primordium，anti-weed-moulds， dry-wet ratio and yields. There were 19 bands in total and 18 types of bands detected from the 23 wild strains. The mobility rate（Rf） of bands ranged from 16.6 to 88.6， and the distribution frequency ranged from 4.3% to 100.0%. Three of the bands were the characteristic bands in esterase isozyme bands of Baise A. auricular. The genetic similarity coefficients ranged from 0.68 to 1.00 among the 23 wild strains. The 23 wild strains could be divided into two groups at the similarity coefficient of 0.68. And the cluster analysis results of most strains were agreed with their geographical distribution. 【Conclusion】Baise A. auricular wild strains in Guangxi possesses high genetic diversity，implies many good genetic characters and has great potential for exploitation and utilization. Key words： Baise Auricularia auricular； wild strains； genetic diversity； agronomic characters； esterase isozyme
0 引言
【研究意义】云耳（Auricularia auricular）是我国南方地区对黑木耳的一种俗称，隶属于担子菌亚门异担子菌纲木耳目木耳科木耳属（戴玉成等，2010），在我国广泛分布，其产量仅次于香菇和平菇，为四大食用菌之一（中国食用菌协会，2013；冯小飞等，2016）。百色云耳是指自然分布于广西百色地区各县（区）的野生黑木耳，以田林县分布最广、产量最高、品质优良，曾多次在全国黑木耳质量评比中名列三甲，远销港澳及东南亚等地，是广西特有的黑木耳（农训学，2009；谢毅栋，2009）。百色云耳属于适合南亚热带植被地理条件生长的典型生态种群，也是我国黑木耳的一个重要生态类群（李发盛等，2008b；黄艳芳等，2012）。因此，开展百色云耳的遗传多样性研究对其种质鉴定、驯化栽培、资源保护及遗传育种具有重要意义。【前人研究进展】目前，种质资源的遗传多样性主要通过形态学标记、细胞学标记、生物化学标记和分子遗传标记等方法进行研究。有关黑木耳的遗传多样性研究已有较多报道。唐利华等（2007）通过酯酶同工酶分析对我国34个主栽的黑木耳菌株进行遗传多样性研究，结果表明其遗传背景差异不明显。陶梅等（2009）通过体细胞不亲和性反应和ITS序列分析对黑龙江省黑木耳栽培菌株进行亲缘关系研究，结果表明其亲缘关系较近，遗传多样性不丰富。Tang等（2010）分别采用ISSR和SRAP分子标记技术对黑龙江省黑木耳菌株的遗传多样性进行分析，结果表明其具有较丰富的遗传多样性。陶朋飞和许修宏（2011）应用ITS和SRAP分子标记技术分析黑龙江省野生黑木耳菌株的遗传多样性，结果表明其具有较丰富的遗传多样性。钱雪婷（2016）通过农艺学性状描述、酯酶同工酶分析试验、体细胞不亲和性反应和ITS序列分析对秦巴山区的45个黑木耳菌株的遗传多样性进行研究，结果发现其遗传多样性较丰富。有关百色云耳的研究报道，李发盛等（2008b）、黄艳芳等（2012）研究发现，百色云耳形态特征与东北主推的黑木耳品种存在明显差异；王灿琴等（2012）对5个百色云耳菌株的菌丝生长状况、子实体形态、出菇期和产量等性状进行比较分析，结果表明不同菌株的农艺性状存在明显差异。【本研究切入点】目前，针对百色云耳野生种群资源的研究仅限于形态学或农艺性状指标的观察及测定，涉及的菌株数量也很少，尚缺乏全面系统的研究，尤其鲜见有关百色云耳野生菌株遗传多样性的研究报道。【拟解决的关键问题】将农艺性状测定与酯酶同工酶分析试验相结合，对23个百色云耳野生菌株进行遗传多样性分析，以期挖掘百色云耳优良性状和优异基因，为其种质资源的保护和开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试百色云耳野生菌株共23个，其名称、采集时间和采集地见表1。N，N-亚甲双丙烯酰胺、α，β-乙酸萘酯、坚固蓝等主要试剂购自生工生物工程（上海）股份有限公司。主要仪器设备：电泳仪（DYCZ-24，北京市六一仪器厂）、恒温水浴锅（HH-W420，江苏省金坛市医疗仪器厂）、高速冷冻离心机（TGL-16G，上海安亭科学仪器厂）和摇床（QYC-211，上海福玛实验设备有限公司）等。
1. 2 农艺性状测定
于2016年10月～2017年3月采用袋料栽培方式进行云耳菌株的出耳试验。栽培袋料配方：阔叶树木屑78%，麦麸20%，石膏1%，石灰1%。按照任建平（2015）的方法进行栽培袋料配制、装袋、高压灭菌和接种，每个菌株制备菌包90袋。接种后的菌包置于28 ℃培养室培养，期间记录从接种至多数菌包开始形成原基所需的天数，即原基形成时间。菌丝满袋并有少量原基形成时，将菌包移至出菇棚，按照任建平（2015）的方法进行催耳芽和出耳管理。出耳期间，观察记录云耳的着生方式，统计菌包杂菌感染率。待云耳耳片充分舒展，耳基收缩，耳边内卷，腹凹面出现白色孢子粉后，采收第一潮云耳。采收时记录云耳子实体形态，并统计产量，产量按生物学效率计算，即生物学效率（%）=第一潮云耳鲜重（kg）/栽培袋料干重（kg）×100。同时测定每个菌株子实体的干湿比，干湿比=吸水完全的云耳鲜重（kg）/云耳干重（kg）。
1. 3 酯酶同工酶酶谱分析
将菌丝刚长满试管斜面的云耳菌株接种于装有PDA液体培养基的三角瓶中，于28 ℃摇床培养25 d，然后过滤菌丝，挤干水分。按照韦仕岩等（2014）的方法制备酯酶同工酶样品，并进行电泳、染色及酶谱分析。
1. 4 统计分析
基于上述酯酶同工酶的电泳数据，以NTSYS-PC计算不同菌株间遗传相似系数。采用不加权成对群算术平均法（UPGMA）进行云耳菌株的遗传相似性聚类分析，构建系统发育进化树。
2 结果与分析
2. 1 百色云耳野生菌株的农艺性状测定结果
2. 1. 1 形态特征 由表2可知，在23个百色云耳野生菌株中，子实体朵形为单生的有16个，簇生的有7个；耳片边缘平滑的有13个，波浪状的有10个；耳片背面筋道脉纹明显或较明显的有15个，不明显或无脉纹的有8个；耳片颜色浅黄褐色的有4个，黄褐色的有8个，黑褐色的有11个；耳片长度30.1～51.6 mm；耳片宽度20.5～41.7 mm；耳片厚度0.95～1.44 mm。其中，菌株TY011、TY012、TY013、TY026和TY051具有良好的子实体形态，单生，耳片边缘平滑，脉纹不明显，耳片也较大（长×宽>39.0 mm×28.0 mm，下同），但耳片较薄（厚度<1.00 mm，下同）；菌株TY031也具有良好的子实体形态，多为单生，耳片边缘平滑，脉纹不明显，耳片厚（1.25 mm）但较小（仅32.8 mm×22.9 mm）；菌株TY041、YE1、YE2、YE3和YE6的耳片较大且厚（厚度>1.00 mm，下同），但耳片邊缘呈波浪状，部分菌株脉纹较多；菌株TY052.1和TY052.2的耳片较大，但子实体其他形态均较差；菌株TY022、TY023、TY024、TY053、TY054、TY055、TY061、TY062和TY063的耳片均较厚，尤其是菌株TY024的耳片厚度为1.44 mm，但子实体其他形态均较差。综上所述，百色云耳野生菌的形态特征具有丰富的多样性，且含有较多优良的外观性状。 2. 1. 2 栽培性状 由表3可知，23个百色云耳野生菌株中，菌株TY011、TY012、TY023、TY24、TY026、TY041、TY062、YE1和YE3为早熟型品种，原基形成时间仅26～32 d；菌株TY031、TY051、TY061、TY013、YE2和YE6为中熟型品种，原基形成时间为36～45 d；其余菌株均为晚熟型品种，原基形成时间为48～59 d。菌株TY013、TY024、TY026、TY041、TY063、YE1、YE2、YE3和YE6有较高的抗杂菌能力，杂菌感染率均低于8.0%；菌株TY012、TY022、TY031、TY042、TY053、TY054和TY062的抗杂菌能力较差，杂菌感染率均高于22.0%，最高达51.1%。菌株TY026、TY041、TY042、YE1、YE2、YE3和YE6的产量均较高，第一潮产量达41.7%～50.5%；菌株TY022、TY023、TY031、TY053、TY054和TY062的产量较低，第一潮产量仅8.2%～15.3%。不同百色云耳菌株耳片的干湿比为10.1～14.1，表明不同菌株间耳片的干湿比存在明显差异。综上所述，百色云耳野生菌的原基形成时间、抗杂能力、产量和子实体干湿比等栽培学性状多样性丰富，可满足不同栽培需求，并蕴含较多的优良栽培性状。
2. 2 百色云耳野生菌株的酯酶同工酶酶谱分析结果
对23个云耳野生菌株的酯酶同工酶样品进行电泳，酶谱如图1所示。根据酶谱进行酶带分布特征和迁移率分析，结果如图2所示。由图1和图2可知，从23个百色云耳菌株共检测出19条谱带，有18种谱带类型，各菌株的谱带数4～10条，各谱带的迁移率（Rf）为16.6～88.6，分布频率为4.3%～100.0%，其中带6和带8的分布频率均达100.0%，为百色云耳酯酶同工酶的特征谱带，带7的分布频率为82.6%，也可能是百色云耳的特征谱带。可见，百色云耳野生菌的酯酶同工酶酶谱多态性非常丰富。
2. 3 聚类分析结果
利用NTSYS-PC对23个百色云耳野生菌株的酯酶同工酶谱带数据进行聚类分析，结果如图3所示。23个百色云耳野生菌株的遗传相似系数为0.68～1.00，遗传差异变化较大，说明百色云耳菌株的遗传背景较丰富。在遗传相似系数为0.68时，可将23个菌株分为两大类：第一类包括菌株YE1、TY011、TY012、TY055、YE3、TY013和TY026共7个菌株；第二类包括菌株YE2、YE6、TY022、TY042、TY051、TY023、TY024、TY031、TY041、TY053、TY054、TY061、TY062、TY063、TY052.1和TY052.2共16个菌株。结合菌株的农艺性状进行分析，结果表明两大类的菌株在耳片颜色上存在差异。其中，第一类菌株的耳片颜色较浅，呈浅黄褐色至黄褐色，第二类菌株的耳片颜色较深，呈黄褐色至黑褐色；其他农艺性状与聚类结果间未见相吻合的规律。第一类的7个菌株中，菌株TY011、TY012和TY013均来自田林县定安镇，第二类的16个菌株中，菌株TY041、TY042等11个菌株来自田林县八渡乡，说明同一来源地的菌株遗传背景差异较小，亲缘关系较近的可能性较大。不同菌株还可能存在同物异名现象，第一类中，菌株TY011与TY012的遗传相似系数为1.00，且与菌株YE1的遗传相似系数也达0.95，表明这3个菌株存在同物异名的可能性很大；第二类中，菌株TY023与TY024、菌株TY062与TY063、菌株TY052.1与TY052.2及菌株TY053、TY054、TY061与TY041间的遗传相似系数均大于0.95，均可能存在同物异名的现象。
3 讨论
种质资源遗传多样性是农艺性状、细胞学、生物化学及分子遗传标记等方面多样性的综合体现（季维智和宿兵，1999；钱雪婷，2016）。对于黑木耳而言，子实体朵形、腹背面脉纹（皱褶）、耳片颜色、大小和厚度等形态特征及干湿比、原基形成时间、抗杂性和产量等栽培性状是最常用的农艺性状指标（陈影等，2014）。本研究的23个百色云耳菌株在子实体朵形、耳片背面脉纹、颜色和大小等形态特征上具有丰富的多样性。我国秦巴山区和东北地区的黑木耳的农艺性状也呈较高的多样性（马庆芳等，2007；钱雪婷，2016）。黄艳芳等（2012）研究认为，百色云耳以单生为主、簇生极少，颜色棕褐色，无脉纹。该结论未体现百色云耳外观形态性状的多样性，可能与其观测的菌株数量少（僅6个）有关。王灿琴等（2012）分离得到的5个百色云耳菌株在形态特征、产量和抗杂性等方面存在明显差异。本研究结果显示，23个百色云耳野生菌株的原基形成时间为26～59 d，可分为早熟型、中早熟型和晚熟型3种类型，与马庆芳等（2007）根据出耳周期对东北地区黑木耳的划分结果基本一致；不同菌株的杂菌感染率0～51.1%，产量8.2%～50.5%，说明抗杂性和产量差异明显。可见，百色云耳菌株在原基形成时间、抗杂性和产量等栽培性状上也具有丰富的多样性。
丰富的农艺性状多样性是挖掘云耳优良性状和品种选育的物质基础。很多科研人员均是从农艺性状丰富多样的黑木耳野生种质资源中筛选培育出生长旺盛、抗杂性强、产量高的优良菌株（马庆芳等，2007；钱雪婷，2016；翟玉，2016）。本研究结果表明，百色云耳野生资源蕴含着较多优良性状，如菌株TY011、TY012和TY031等的子实体形态良好，菌株TY024等的耳片较厚，菌株TY013、TY024和TY026等的抗杂性强，菌株TY026、YE2和YE6等产量高，具有较大的开发利用潜力。李发盛等（2008a，2009）从百色云耳野生资源中筛选驯化出一株适合桑枝栽培的高产菌株百云6号；陈雪凤等（2016a，2018）从百色云耳野生资源中分别筛选出富集钙和铁能力强的菌株及耐高温的菌株。可见，百色云耳野生资源优异性状基因的挖掘潜力巨大。 酯酶同工酶作为基因表达的产物，其谱带的差异间接代表了DNA分子变异，因此，酯酶同工酶技术是研究生物群体遗传差异的重要手段之一，现已广泛应用于木耳等食用菌的鉴别及遗传多样性分析（边银丙等，2000；唐利华等，2007；韦仕岩等，2014；陈雪凤等，2016b）。本研究采用酯酶同工酶技术对23个百色云耳野生菌株进行遗传多样性分析，结果显示从23个菌株中共检测出19条谱带，有18种谱带类型，表明百色云耳野生菌株的酯酶同工酶多态性较高，遗传多样性丰富；其遗传相似系数为0.68～1.00，说明23个菌株间发生明显遗传变异，亲缘关系较近。同样采用酯酶同工酶技术，翟玉（2016）研究发现，东北地区和云南地区的33个黑木耳菌株的遺传相似系数为0.52～1.00；唐利华等（2007）研究发现，来自国内不同地区的34个黑木耳栽培菌株的遗传相似系数为0.14～1.00。与上述研究结果相比，本研究中百色云耳菌株间的遗传相似系数较高，其原因可能是供试的百色云耳仅采集于田林县或近邻县，地理范围太狭窄，遗传背景相似。
聚类分析是基于亲缘关系进行归类。翟玉（2016）研究表明，来自云南和东北地区的33个黑木耳的聚类结果与其地理位置高度吻合。本研究将23个百色云耳野生菌株划分为两大类，第一类有7个菌株，来自定安镇的3个菌株均归在该类；第二类有16个菌株，来自八渡乡的12个菌株中有11个菌株归在该类，表明来自地理位置相近的云耳菌株遗传背景差异越小，亲缘关系较近的可能性较大。但唐利华等（2007）研究发现，来自国内34个黑木耳栽培菌株聚类结果与其地理位置不吻合，可能与栽培菌株在我国各地穿插引种频繁有关。本研究还发现，个别来自不同乡（镇）的百色云耳野生菌株间亲缘关系也很近，如田林县浪平乡的菌株YE1和田林县定安镇的TY011和TY012遗传相似系数达0.95，可能是不同地域间相互引种栽培造成。此外，本研究结果显示23个百色云耳野生菌株的聚类结果与其耳片颜色具有较好的相关性，其中第一类菌株耳片颜色偏浅，呈浅黄褐色至黄褐色，第二类菌株的耳片颜色较深，呈黄褐色至黑褐色，由于两个类群中均有黄褐色的菌株，且颜色深浅受栽培环境的影响较大，因此，仅用颜色指标作为划分百色云耳亲缘关系的依据并不科学。本研究供试的百色云耳野生菌株多数来自百色田林县，无法全面、准确地反映百色云耳野生菌株的遗传多样性。在今后的研究中，应扩大采集菌株的地理范围，收集更多的菌株，并将多种技术相结合对百色云耳野生菌株开展系统地研究，为其种群资源的保护和开发利用提供参考。
4 结论
百色云耳野生菌株具有丰富的遗传多样性，蕴含着较多的优异遗传性状，具有较大的开发利用潜力。
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（责任编辑 陈 燕）