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摘 要 为了研究尖孢镰刀菌古巴专化型G蛋白β亚基编码基因fgb1的功能，构建fgb1基因敲除突变体，分析fgb1敲除突变体的表型。结果表明：敲除fgb1基因导致突变体菌落在PDA培养基上生长减慢，产孢量和菌丝分枝减少；致病性测定结果表明fgb1基因敲除突变体对巴西蕉的致病性减弱；用激光共聚焦显微镜观察感病香蕉根系，发现fgb1基因敲除突变体仍可在根系维管束中定殖。本研究结果为进一步研究G蛋白信号传导途径在尖孢镰刀菌古巴专化型中的作用奠定了基础 。
关键词 尖孢镰刀菌古巴专化型；G蛋白；致病性；生长；发育
中图分类号 Q789 文献标识码 A
Abstract To investigate the function of the G-protein gene fgb1 in the banana fungal pathogen Fusarium oxysporum f. sp. cubense（Foc），the fgb1 deletion mutants were constructed. Phenotypical analysis revealed that deletion of fgb1 gene led to several alterations including slower growth rate on potato dextrose agar（PDA）plates，reduced conidiation and less branches of mycelia compared to the wild-type strain. The fgb1 deletion mutants showed decreased pathogenicity to the banana（Musa spp. cv. Brazil），but the mutant could still invade the vascular bundles of banana roots. The results lay a foundation for studying the roles of G-protein in Foc.
Key words Fusarium oxysporum f. sp. cubense；G-protein；Pathogenicity；Growth；Development
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.11.018
尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）可从香蕉根系侵入并造成维管束萎蔫和植株枯萎，是制约香蕉生产的重要病原菌之一。同时，尖孢镰刀菌古巴专化型可在土壤中存活多年，化学药剂难以有效防治，选用抗病香蕉品种是防治香蕉枯萎病的有效措施[1]。抗病香蕉品种的选育依赖于对香蕉与枯萎病菌的相互作用机制以及病原菌致病机理的深入理解。
目前有关尖孢镰刀菌致病机理的研究已取得相当进展。许多重要致病基因已被鉴定，包括fmk1、ste12、chs2、chs7、chsV、rho1、fow1、fow2、six1和 frp1等基因[2-3]，这为进一步揭示尖孢镰刀菌致病信号网络奠定了基础。近年来，尖孢镰刀菌古巴专化型致病基因的研究也取得了一些重要进展。相关学者通过构建尖孢镰刀菌T-DNA插入突变体库，鉴定了一些致病力减弱或丧失的突变体，并进一步鉴定了T-DNA所插入的基因序列[4-7]。Qi等[8]通过基因敲除策略鉴定了转录因子编码基因foatf1等重要致病基因。
G蛋白在真菌生长、发育和致病力等方面具有重要的调控作用[9]。部分学者研究发现尖孢镰刀菌G蛋白具有相似的功能。Jain等[10-11]首先通过基因破坏策略研究了尖孢镰刀菌黄瓜专化型（F. oxysporum f. sp. cucumerinum）G蛋白α和β亚基编码基因fga1、fga2、fgb1的功能，结果发现fga1和fgb1基因失活突变体对黄瓜的致病力减弱，其菌落形态、产孢量、孢子萌发率和耐热性等发生显著变化。fga2基因失活突变体对黄瓜的致病性完全丧失，但是菌落形态和产孢量并没有发生明显改变[12]。Delgado-Jarana等[13]研究结果发现，G蛋白β亚基FGB1可通过依赖环化腺苷酸（cAMP）的途径或不依赖cAMP的信号途径调控菌丝的生长、发育和致病性。尽管关于这些G蛋白编码基因的功能在尖孢镰刀菌黄瓜专化型中已有所阐明，但与其在尖孢镰刀菌古巴专化型中的功能是否一致仍有待验证。
因此笔者通过DNA重组策略敲除古巴专化型菌株fgb1基因，以验证G蛋白β亚基编码基因在尖孢镰刀菌古巴专化型菌株中的功能。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 培养基 PDA培养基（马铃薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂20 g/L）；PDB成分与PDA相同，但不加琼脂；再生培养基（马铃薯200 g/L、蔗糖174 g/L、琼脂20 g/L）。
1.1.2 试剂 转化使用的溶液为STC溶液[1.2 mol/L山梨醇、 0.5%氯化钙、 100 mmol/L Tris-HCL（pH7.0）、 25 mmol/L EDTA]； PTC溶液[STC溶液、 10%（W/V）PEG4000]； 0.7 mol/L氯化钠溶液；Driselase崩溃酶溶液（20 mg/mL， Sigma）；溶壁酶Lysing Enzyme（广州微生物研究所）。
1.1.3 供试菌株和质粒 尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）4号小种菌株B2分离自感病的巴西蕉；pCT74质粒由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所微生物资源研究利用课题组保存。 1.1.4 供试香蕉品种 巴西蕉（Musa sp. AAA）试管苗由中国热带农业科学院组织培养中心提供。试管苗经清水洗净后种于砂土中，栽培1个月左右。
1.2 方法
1.2.1 真菌基因组DNA提取 将B2菌株接种于PDB培养基，以150 r/min、28 ℃摇床震荡培养5 d，过滤收集菌丝体，沥干后用于基因组DNA提取。 DNA提取采用CTAB法[14-15]。
1.2.2 fgb1基因敲除载体的构建 以基因组DNA为模板，用引物对AF（5′-ggggtaccGACGGTTACGAT
TGAGTGA-3′，小写字母线碱基为KpnⅠ识别序列）和AR（5′-ccgctcgagTGAAGTTGGTGGATGGATG-3′，
小写字母碱基为XhoⅠ识别序列）进行PCR扩增，获得fgb1基因开放阅读框上游5′端同源臂DNA；用引物对BF（5′-cggaattcCGGCGACTATACCATCTG
-3′，小写字母碱基为EcoRⅠ识别序列）和BR（5′-tgctctagaGACATCAAGAGCGATACCA-3′，小写字母碱基为XbaⅠ识别序列）进行PCR扩增，获得下游3′端同源臂DNA。PCR扩增采用Premix TaqTM试剂（TaKaRa，Dalian），扩增条件为：95 ℃预变性5 min，然后进行35个扩增循环（95 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min），最后72 ℃保温5 min。将所扩增的DNA片段分别连接于pMD19T载体，形成pMD19T-5A和pMD19T-3B克隆载体。再用限制性内切酶KpnⅠ和XhoⅠ、EcoRⅠ和 XbaⅠ从克隆载体上切下5′端和3′端同源臂DNA，将其分别连接于经相同限制性内切酶酶切的线性pCT74载体（包含潮霉素抗性基因hph和gfp基因表达盒）中，构建成pCT74-fgb1载体。最后用KpnⅠ和XbaⅠ从pCT74-fgb1载体中切下用于转化的DNA片断，经回收纯化后备用。
1.2.3 尖孢镰刀菌原生质体制备和DNA转化 参照谢德啸等[16]报道的方法。
1.2.4 fgb1基因敲除突变体的鉴定 采用CTAB法提取转化子基因组DNA，经紫外分光光度计检测合格后，将其作为PCR扩增的模板。分别以转化子和野生型菌株B2基因组DNA为模板，采用引物F1（5′-AGGTCGGATTGGATGGAGTG-3′）和F2（5′-CGTTGCAAGACCTGCCTGAA-3′）进PCR扩增，检测转化子是否在fgb1基因开放阅读框5′端发生同源重组；用引物C1（5′-ATGAACTCGCAAGG
CAACAG-3′）和C2（5′-TCATTTTCCTCTCGGTGTAC
CG-3′）进行PCR扩增，检测转化子是否存在fgb1基因开放阅读框，预计分别扩增约1 663 bp和1 380 bp的 DNA片段。如果用F1和F2引物进行PCR扩增结果为阳性，而用C1和C2 引物进行PCR扩增结果为阴性，那么这类转化子即为fgb1基因敲除突变体。PCR扩增采用Premix TaqTM试剂（TaKaRa，Dalian），扩增条件为：95 ℃预变性5 min，然后进行35个扩增循环（95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min），最后72 ℃保温5 min。
1.2.5 突变体菌落形态观察 用体式显微镜（SZX7，Olympus）放大10倍观察单菌落形态并拍照。
1.2.6 孢子悬浮液配制 将fgb1基因敲除突变体和野生型菌株B2分别接种于200 mL的PDB培养基中，置于25 ℃、180 r/min的摇床中震荡培养7 d。离心收集菌体，用蒸馏水重悬，将分生孢子悬浮液浓度调至106个/mL。
1.2.7 致病性测定及病情统计 将香蕉苗用清水洗净根部沙土后，各取约30株幼苗，将其根系分别浸于fgb1敲除突变体和野生型菌株B2孢子悬浮液中，放置5 min后取出，重新种于土中，以无菌水浸泡5 min作为对照。经处理后按照常规方法栽培管理，并观察植株的发病情况。3周后调查病害发生情况，从球茎中间纵向切开，观察球茎褐变程度以及叶片黄化情况，记录每株幼苗发病级数，病害分级参考郭立佳等[14]的方法。
1.2.8 激光共聚焦显微观察 取感病的香蕉根系进行徒手切片，临时制片，置于激光共聚焦显微镜（FV1000，Olympus）下，用波长为488 nm的光线激发，具体参照Hamm等[17]所述方法进行。
1.3 数据统计分析
接种fgb1基因突变体和野生型菌株B2的香蕉幼苗发病情况用病情指数表示，病情指数计算采用此公式：病情指数=100×[∑（植株发病级数×对应株数）/（植株发病最高级数×总株数）]。数据采用SigmaPlot 12.5软件统计分析模块进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 fgb1基因敲除载体构建
用4种限制性内切酶对所构建的质粒pCT74-fgb1进行酶切分析。结果表明（图1），用KpnⅠ和 XhoⅠ酶切可从载体上切下预计约600 bp的DNA条带；用 EcoRⅠ和XbaⅠ酶切，也可切下约800 bp的DNA条带。测序结果表明所克隆的DNA序列正确，说明fgb1基因敲除载体已构建成功。
2.2 PCR鉴定fgb1敲除突变体
经再生培养和潮霉素抗性筛选，获得一批转化子，挑选其中的6个转化子，提取基因组DNA，以其为模板，用C1/C2引物对进行PCR扩增，结果显示转化子D1～D3和清水对照无扩增条带，D4～D6和野生型菌株B2均有1.4 kb左右的DNA扩增条带；用F1/F2引物对进行PCR扩增，结果显示，以转化子D1～D4基因组DNA为模板，可扩增到约1.6 kb的DNA条带，其余模板及清水对照均无PCR扩增条带（图2）。结果表明D1～D3转化子均为fgb1基因敲除突变体，分别命名为Δfgb1-1、Δfgb1-2、Δfgb1-3。 2.3 fgb1基因敲除突变体表型分析
fgb1基因敲除突变体菌株Δfgb1-1和Δfgb1-2与野生型菌株B2在PDA平板上形成的菌落形态相似（图3-A）；在PDA平板上划线培养36 h，野生型菌株B2的菌丝呈辐射状向四周生长，与之不同，突变体菌株Δfgb1-1的菌丝呈直线沿两端生长，菌丝分枝明显减少（图3-B）。将野生型菌株B2与fgb1敲除突变体菌株Δfgb1-1和Δfgb1-2分别接种于PDA平板上并培养4 d，测量其菌落直径，结果表明野生型菌落平均直径（4.88 cm）极显著（t测验，p<0.01）大于突变体菌株Δfgb1-1（4.30 cm）和Δfgb1-2（4.32 cm）菌落平均直径（图3-C）。在PDA平板上培养7 d，Δfgb1-1和Δfgb1-2突变体菌株单菌落产孢量（1.1×109和1.3×109，图3-D）低于野生型菌株B2（2.3×109）。可见，fgb1基因的敲除导致突变体菌株菌丝分枝减少，菌落生长减慢，产孢量减少。
2.4 fgb1敲除突变体对巴西蕉的致病性
统计接种野生型菌株B2与fgb1敲除突变体菌株Δfgb1-1和Δfgb1-2的巴西蕉病情指数。发现接种fgb1敲除突变体菌株Δfgb1-1和Δfgb1-2的巴西蕉幼苗平均病情指数（15.3和17.8，图4）均显著（t测验，p<0.01）低于野生型菌株B2（63.7，图4）。结果表明fgb1敲除突变体对巴西蕉的致病性显著降低。
2.5 fgb1敲除突变体在巴西蕉根系中的侵染情况 用共聚焦激光显微镜观察fgb1基因敲除突变体菌株在根系中的定殖，结果发现其既可在根系皮层定殖（图5-A），也可侵入根系维管束，在木质部定殖（图5-B）。结果表明fgb1基因敲除突变体虽然致病力减弱，但其仍可侵染巴西蕉根系，并在维管束定殖。
3 讨论与结论
在真核生物中，G蛋白在细胞的生长发育等生物学过程中具有重要作用。由G蛋白α、β和γ亚基组成的异源三聚体在结合GDP时无活性，由受体催化的鸟嘌呤核苷酸交换使GTP结合到α亚基上，导致α亚基的活化，并与β和γ亚基解离，随后游离的Gα亚基和Gβγ异二聚体激活下游的效应物。当GTP水解为GDP时，α亚基失活，细胞响应完成[17]。不同真菌的G蛋白氨基酸序列之间具有较高的相似性，其中β亚基氨基酸序列中包含2个保守基序即IYAMHW和GHDNRV[10]，因此其在功能上也具有相当的保守性。尖孢镰刀菌不同专化型菌株的G蛋白β亚基的氨基酸序列之间也具有很高的相似性，Jain等[10]和Delgado-Jarana等[13]研究发现尖孢镰刀菌黄瓜专化型和番茄专化型的G蛋白β亚基具有一致的功能，即调控菌丝生长、发育和致病性，笔者发现G蛋白β亚基在尖孢镰刀菌古巴专化型中也具有基本相同的功能，包括调控菌丝生长、菌丝分枝和产孢量以及致病性。它们的差别如下：在尖孢镰刀菌古巴专化型中，敲除fgb1导致菌丝生长减缓（图3），而在尖孢镰刀菌黄瓜专化型和番茄专化型中，敲除fgb1则促进菌丝生长[10，13]。
尽管关于fgb1基因在尖孢镰刀菌黄瓜专化型和番茄专化型菌株中的功能已有所阐明，但fgb1敲除突变体是否能侵入根系维管束仍是未知。笔者采用gfp和潮霉素抗性hph基因，通过DNA同源重组替换fgb1基因（图2），所得的fgb1基因敲除突变体携带gfp基因，因此可用荧光显微镜观察突变体在香蕉植株中的侵染和定殖情况。通过用激光共聚焦显微镜观察fgb1突变体在巴西蕉根系中的定殖，笔者发现其可穿透根系皮层和进入维管束木质部，并在其中定殖（图5）。这与以GFP标记的野生型菌株在巴西蕉根系中的侵染定殖方式相似[18]。与此不同，Inoue等[19]研究发现，破坏Fow1基因导致突变体菌株对西甜瓜的致病性显著降低，突变体菌株只能穿透西甜瓜根系表皮，而不能侵入维管束。Kim等[20]发现，破坏尖孢镰刀菌蛋白激酶A编码基因FoCPKA导致突变体菌株不能侵入拟南芥根系维管束。因此，可推测G蛋白β亚基FGB1调控尖孢镰刀菌的致病性可能是通过采用不同于Fow1和FoCPKA的信号途径。此外，与野生型菌株相比，fgb1基因突变体致病力虽然显著减弱，但是其仍然能侵入香蕉根系木质部维管束，笔者推测这可能是由于fgb1基因敲除突变体在侵染香蕉根系的过程中受到宿主的防御，其侵染性生长受一定程度的限制，但仍然能以较慢的速度侵入木质部维管束，其具体机制仍有待进一步研究。
笔者通过构建fgb1基因敲除突变体，分析突变体表型，发现FGB1可调控尖孢镰刀菌古巴专化型菌丝的生长、发育和致病性，其调控尖孢镰刀菌古巴专化型的致病性可能是通过采用不同于Fow1 和蛋白激酶A（FoCPKA）的信号途径。本研究结果为进一步研究G蛋白信号传导途径在尖孢镰刀菌古巴专化型致病过程中的作用奠定了基础。
参考文献
[1] Michielse C B， Rep M. Pathogen profile update： Fusarium oxysporum[J]. Molecular Plant Pathology， 2009， 10（3）： 311-324.
[2] Michielse C B， van Wijk R， Reijnen L， et al. Insight into the molecular requirements for pathogenicity of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici through large-scale insertional mutagenesis[J]. Genome Biology， 2009， 10（1）： R4.
[3] Pietro A D， Madrid M P， Caracuel Z， et al. Fusarium oxysporum： exploring the molecular arsenal of a vascular wilt fungus[J]. Molecular Plant Pathology， 2003， 4（5）： 315-325. [4] 李敏慧， 庄楚雄， 姜子德. 香蕉枯萎病菌4号生理小种致病相关基因foABC1的分离[J]. 菌物研究， 2006， 4（3）： 94-95.
[5]吴飞宏， 曾 涛， 陈汉清， 等. 尖镰孢古巴专化型4号小种T-DNA插入突变体Focr4-1562及其基因敲除子的生物学表型研究[J]. 菌物学报， 2012， 31（4）： 584-592.
[6]蒋艳琴， 曾 涛， 陈汉清， 等. 尖镰孢古巴专化型Focr4-1701突变体的生物学表型研究[J]. 基因组学与应用生物学， 2013， 32（3）： 339-346.
[7] Li M H， Xie X L， Lin X F， et al. Functional characterization of the gene FoOCH1 encoding a putative α-1，6-mannosyltransferase in Fusarium oxysporum f. sp. cubense[J]. Fungal Genetics and Biology， 2014， 65： 1-13.
[8] Qi X Z， Guo L J， Yang L Y， et al. Foatf1， a bZIP transcription factor of Fusarium oxysporum f. sp. cubense， is involved in pathogenesis by regulating the oxidative stress responses of Cavendish banana（Musa spp.）[J]. Physiological and Molecular Plant Pathology， 2013， 84：76-85.
[9] Li L D， Wright S J， Krystofova S， et al. Heterotrimeric G protein signaling in filamentous fungi[J]. Annual Review of Microbiology， 2007， 61（1）： 423-452.
[10] Jain S， Akiyama K， Kan T， et al. The G protein β subunit FGB1 regulates development and pathogenicity in Fusarium oxysporum[J]. Current Genetics， 2003， 43（2）： 79-86.
[11] Jain S， Akiyama K， Mae K， et al. Targeted disruption of a G protein α subunit gene results in reduced pathogenicity in Fusarium oxysporum[J]. Current Genetics， 2002， 41（6）： 407-413.
[12] Jain S， Akiyama K， Takata R， et al. Signaling via the G protein α subunit FGA2 is necessary for pathogenesis in Fusarium oxysporum[J]. FEMS Microbiology Letters， 2005， 243（1）： 165-172.
[13] Delgado-Jarana J， Martinez-Rocha A L， Roldan-Rodriguez R， et al. Fusarium oxysporum G-protein β subunit Fgb1 regulates hyphal growth， development， and virulence through multiple signalling pathways[J]. Fungal Genetics and Biology， 2005， 42（1）： 61-72.
[14] 郭立佳， 彭 军， 杨腊英， 等. 大蕉枯萎病病原菌的分离、鉴定和致病性测定[J]. 热带作物学报， 2013， 34（1）： 105-110.
[15]郭立佳， 黄俊生， 王国芬， 等. 香蕉黑腐病菌（Botryodiplodia theobromae）的PCR检测[J]. 植物病理学报， 2007， 37（3）： 248-254.
[16]谢德啸， 羊玉花， 周端咏， 等. 尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种红色荧光蛋白基因转化[J]. 热带作物学报， 2012， 33（4）： 685-689.
[17] Hamm H E. The many faces of G protein signaling[J]. The Journal of Biological Chemistry， 1998， 273（2）： 669-672.
[18] 郭立佳， 梁昌聪， 张建华， 等. 香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种菌株侵染和定殖巴西蕉和粉蕉根系的观察[J]. 热带作物学报， 2013， 34（11）： 2 262-2 266.
[19] Inoue I， Namiki F， Tsuge T. Plant colonization by the vascular wilt fungus Fusarium oxysporum requires FOW1， a gene encoding a mitochondrial protein[J]. The Plant Cell， 2002， 14（8）： 1 869-1 883.
[20] Kim H S， Park S Y， Lee S， et al. Loss of cAMP-dependent protein kinase A affects multiple traits important for root pathogenesis by Fusarium oxysporum[J]. Molecular Plant-microbe Interactions， 2011， 24（6）： 719-732.
关键词 尖孢镰刀菌古巴专化型；G蛋白；致病性；生长；发育
中图分类号 Q789 文献标识码 A
Abstract To investigate the function of the G-protein gene fgb1 in the banana fungal pathogen Fusarium oxysporum f. sp. cubense（Foc），the fgb1 deletion mutants were constructed. Phenotypical analysis revealed that deletion of fgb1 gene led to several alterations including slower growth rate on potato dextrose agar（PDA）plates，reduced conidiation and less branches of mycelia compared to the wild-type strain. The fgb1 deletion mutants showed decreased pathogenicity to the banana（Musa spp. cv. Brazil），but the mutant could still invade the vascular bundles of banana roots. The results lay a foundation for studying the roles of G-protein in Foc.
Key words Fusarium oxysporum f. sp. cubense；G-protein；Pathogenicity；Growth；Development
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.11.018
尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）可从香蕉根系侵入并造成维管束萎蔫和植株枯萎，是制约香蕉生产的重要病原菌之一。同时，尖孢镰刀菌古巴专化型可在土壤中存活多年，化学药剂难以有效防治，选用抗病香蕉品种是防治香蕉枯萎病的有效措施[1]。抗病香蕉品种的选育依赖于对香蕉与枯萎病菌的相互作用机制以及病原菌致病机理的深入理解。
目前有关尖孢镰刀菌致病机理的研究已取得相当进展。许多重要致病基因已被鉴定，包括fmk1、ste12、chs2、chs7、chsV、rho1、fow1、fow2、six1和 frp1等基因[2-3]，这为进一步揭示尖孢镰刀菌致病信号网络奠定了基础。近年来，尖孢镰刀菌古巴专化型致病基因的研究也取得了一些重要进展。相关学者通过构建尖孢镰刀菌T-DNA插入突变体库，鉴定了一些致病力减弱或丧失的突变体，并进一步鉴定了T-DNA所插入的基因序列[4-7]。Qi等[8]通过基因敲除策略鉴定了转录因子编码基因foatf1等重要致病基因。
G蛋白在真菌生长、发育和致病力等方面具有重要的调控作用[9]。部分学者研究发现尖孢镰刀菌G蛋白具有相似的功能。Jain等[10-11]首先通过基因破坏策略研究了尖孢镰刀菌黄瓜专化型（F. oxysporum f. sp. cucumerinum）G蛋白α和β亚基编码基因fga1、fga2、fgb1的功能，结果发现fga1和fgb1基因失活突变体对黄瓜的致病力减弱，其菌落形态、产孢量、孢子萌发率和耐热性等发生显著变化。fga2基因失活突变体对黄瓜的致病性完全丧失，但是菌落形态和产孢量并没有发生明显改变[12]。Delgado-Jarana等[13]研究结果发现，G蛋白β亚基FGB1可通过依赖环化腺苷酸（cAMP）的途径或不依赖cAMP的信号途径调控菌丝的生长、发育和致病性。尽管关于这些G蛋白编码基因的功能在尖孢镰刀菌黄瓜专化型中已有所阐明，但与其在尖孢镰刀菌古巴专化型中的功能是否一致仍有待验证。
因此笔者通过DNA重组策略敲除古巴专化型菌株fgb1基因，以验证G蛋白β亚基编码基因在尖孢镰刀菌古巴专化型菌株中的功能。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 培养基 PDA培养基（马铃薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂20 g/L）；PDB成分与PDA相同，但不加琼脂；再生培养基（马铃薯200 g/L、蔗糖174 g/L、琼脂20 g/L）。
1.1.2 试剂 转化使用的溶液为STC溶液[1.2 mol/L山梨醇、 0.5%氯化钙、 100 mmol/L Tris-HCL（pH7.0）、 25 mmol/L EDTA]； PTC溶液[STC溶液、 10%（W/V）PEG4000]； 0.7 mol/L氯化钠溶液；Driselase崩溃酶溶液（20 mg/mL， Sigma）；溶壁酶Lysing Enzyme（广州微生物研究所）。
1.1.3 供试菌株和质粒 尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）4号小种菌株B2分离自感病的巴西蕉；pCT74质粒由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所微生物资源研究利用课题组保存。 1.1.4 供试香蕉品种 巴西蕉（Musa sp. AAA）试管苗由中国热带农业科学院组织培养中心提供。试管苗经清水洗净后种于砂土中，栽培1个月左右。
1.2 方法
1.2.1 真菌基因组DNA提取 将B2菌株接种于PDB培养基，以150 r/min、28 ℃摇床震荡培养5 d，过滤收集菌丝体，沥干后用于基因组DNA提取。 DNA提取采用CTAB法[14-15]。
1.2.2 fgb1基因敲除载体的构建 以基因组DNA为模板，用引物对AF（5′-ggggtaccGACGGTTACGAT
TGAGTGA-3′，小写字母线碱基为KpnⅠ识别序列）和AR（5′-ccgctcgagTGAAGTTGGTGGATGGATG-3′，
小写字母碱基为XhoⅠ识别序列）进行PCR扩增，获得fgb1基因开放阅读框上游5′端同源臂DNA；用引物对BF（5′-cggaattcCGGCGACTATACCATCTG
-3′，小写字母碱基为EcoRⅠ识别序列）和BR（5′-tgctctagaGACATCAAGAGCGATACCA-3′，小写字母碱基为XbaⅠ识别序列）进行PCR扩增，获得下游3′端同源臂DNA。PCR扩增采用Premix TaqTM试剂（TaKaRa，Dalian），扩增条件为：95 ℃预变性5 min，然后进行35个扩增循环（95 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min），最后72 ℃保温5 min。将所扩增的DNA片段分别连接于pMD19T载体，形成pMD19T-5A和pMD19T-3B克隆载体。再用限制性内切酶KpnⅠ和XhoⅠ、EcoRⅠ和 XbaⅠ从克隆载体上切下5′端和3′端同源臂DNA，将其分别连接于经相同限制性内切酶酶切的线性pCT74载体（包含潮霉素抗性基因hph和gfp基因表达盒）中，构建成pCT74-fgb1载体。最后用KpnⅠ和XbaⅠ从pCT74-fgb1载体中切下用于转化的DNA片断，经回收纯化后备用。
1.2.3 尖孢镰刀菌原生质体制备和DNA转化 参照谢德啸等[16]报道的方法。
1.2.4 fgb1基因敲除突变体的鉴定 采用CTAB法提取转化子基因组DNA，经紫外分光光度计检测合格后，将其作为PCR扩增的模板。分别以转化子和野生型菌株B2基因组DNA为模板，采用引物F1（5′-AGGTCGGATTGGATGGAGTG-3′）和F2（5′-CGTTGCAAGACCTGCCTGAA-3′）进PCR扩增，检测转化子是否在fgb1基因开放阅读框5′端发生同源重组；用引物C1（5′-ATGAACTCGCAAGG
CAACAG-3′）和C2（5′-TCATTTTCCTCTCGGTGTAC
CG-3′）进行PCR扩增，检测转化子是否存在fgb1基因开放阅读框，预计分别扩增约1 663 bp和1 380 bp的 DNA片段。如果用F1和F2引物进行PCR扩增结果为阳性，而用C1和C2 引物进行PCR扩增结果为阴性，那么这类转化子即为fgb1基因敲除突变体。PCR扩增采用Premix TaqTM试剂（TaKaRa，Dalian），扩增条件为：95 ℃预变性5 min，然后进行35个扩增循环（95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min），最后72 ℃保温5 min。
1.2.5 突变体菌落形态观察 用体式显微镜（SZX7，Olympus）放大10倍观察单菌落形态并拍照。
1.2.6 孢子悬浮液配制 将fgb1基因敲除突变体和野生型菌株B2分别接种于200 mL的PDB培养基中，置于25 ℃、180 r/min的摇床中震荡培养7 d。离心收集菌体，用蒸馏水重悬，将分生孢子悬浮液浓度调至106个/mL。
1.2.7 致病性测定及病情统计 将香蕉苗用清水洗净根部沙土后，各取约30株幼苗，将其根系分别浸于fgb1敲除突变体和野生型菌株B2孢子悬浮液中，放置5 min后取出，重新种于土中，以无菌水浸泡5 min作为对照。经处理后按照常规方法栽培管理，并观察植株的发病情况。3周后调查病害发生情况，从球茎中间纵向切开，观察球茎褐变程度以及叶片黄化情况，记录每株幼苗发病级数，病害分级参考郭立佳等[14]的方法。
1.2.8 激光共聚焦显微观察 取感病的香蕉根系进行徒手切片，临时制片，置于激光共聚焦显微镜（FV1000，Olympus）下，用波长为488 nm的光线激发，具体参照Hamm等[17]所述方法进行。
1.3 数据统计分析
接种fgb1基因突变体和野生型菌株B2的香蕉幼苗发病情况用病情指数表示，病情指数计算采用此公式：病情指数=100×[∑（植株发病级数×对应株数）/（植株发病最高级数×总株数）]。数据采用SigmaPlot 12.5软件统计分析模块进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 fgb1基因敲除载体构建
用4种限制性内切酶对所构建的质粒pCT74-fgb1进行酶切分析。结果表明（图1），用KpnⅠ和 XhoⅠ酶切可从载体上切下预计约600 bp的DNA条带；用 EcoRⅠ和XbaⅠ酶切，也可切下约800 bp的DNA条带。测序结果表明所克隆的DNA序列正确，说明fgb1基因敲除载体已构建成功。
2.2 PCR鉴定fgb1敲除突变体
经再生培养和潮霉素抗性筛选，获得一批转化子，挑选其中的6个转化子，提取基因组DNA，以其为模板，用C1/C2引物对进行PCR扩增，结果显示转化子D1～D3和清水对照无扩增条带，D4～D6和野生型菌株B2均有1.4 kb左右的DNA扩增条带；用F1/F2引物对进行PCR扩增，结果显示，以转化子D1～D4基因组DNA为模板，可扩增到约1.6 kb的DNA条带，其余模板及清水对照均无PCR扩增条带（图2）。结果表明D1～D3转化子均为fgb1基因敲除突变体，分别命名为Δfgb1-1、Δfgb1-2、Δfgb1-3。 2.3 fgb1基因敲除突变体表型分析
fgb1基因敲除突变体菌株Δfgb1-1和Δfgb1-2与野生型菌株B2在PDA平板上形成的菌落形态相似（图3-A）；在PDA平板上划线培养36 h，野生型菌株B2的菌丝呈辐射状向四周生长，与之不同，突变体菌株Δfgb1-1的菌丝呈直线沿两端生长，菌丝分枝明显减少（图3-B）。将野生型菌株B2与fgb1敲除突变体菌株Δfgb1-1和Δfgb1-2分别接种于PDA平板上并培养4 d，测量其菌落直径，结果表明野生型菌落平均直径（4.88 cm）极显著（t测验，p<0.01）大于突变体菌株Δfgb1-1（4.30 cm）和Δfgb1-2（4.32 cm）菌落平均直径（图3-C）。在PDA平板上培养7 d，Δfgb1-1和Δfgb1-2突变体菌株单菌落产孢量（1.1×109和1.3×109，图3-D）低于野生型菌株B2（2.3×109）。可见，fgb1基因的敲除导致突变体菌株菌丝分枝减少，菌落生长减慢，产孢量减少。
2.4 fgb1敲除突变体对巴西蕉的致病性
统计接种野生型菌株B2与fgb1敲除突变体菌株Δfgb1-1和Δfgb1-2的巴西蕉病情指数。发现接种fgb1敲除突变体菌株Δfgb1-1和Δfgb1-2的巴西蕉幼苗平均病情指数（15.3和17.8，图4）均显著（t测验，p<0.01）低于野生型菌株B2（63.7，图4）。结果表明fgb1敲除突变体对巴西蕉的致病性显著降低。
2.5 fgb1敲除突变体在巴西蕉根系中的侵染情况 用共聚焦激光显微镜观察fgb1基因敲除突变体菌株在根系中的定殖，结果发现其既可在根系皮层定殖（图5-A），也可侵入根系维管束，在木质部定殖（图5-B）。结果表明fgb1基因敲除突变体虽然致病力减弱，但其仍可侵染巴西蕉根系，并在维管束定殖。
3 讨论与结论
在真核生物中，G蛋白在细胞的生长发育等生物学过程中具有重要作用。由G蛋白α、β和γ亚基组成的异源三聚体在结合GDP时无活性，由受体催化的鸟嘌呤核苷酸交换使GTP结合到α亚基上，导致α亚基的活化，并与β和γ亚基解离，随后游离的Gα亚基和Gβγ异二聚体激活下游的效应物。当GTP水解为GDP时，α亚基失活，细胞响应完成[17]。不同真菌的G蛋白氨基酸序列之间具有较高的相似性，其中β亚基氨基酸序列中包含2个保守基序即IYAMHW和GHDNRV[10]，因此其在功能上也具有相当的保守性。尖孢镰刀菌不同专化型菌株的G蛋白β亚基的氨基酸序列之间也具有很高的相似性，Jain等[10]和Delgado-Jarana等[13]研究发现尖孢镰刀菌黄瓜专化型和番茄专化型的G蛋白β亚基具有一致的功能，即调控菌丝生长、发育和致病性，笔者发现G蛋白β亚基在尖孢镰刀菌古巴专化型中也具有基本相同的功能，包括调控菌丝生长、菌丝分枝和产孢量以及致病性。它们的差别如下：在尖孢镰刀菌古巴专化型中，敲除fgb1导致菌丝生长减缓（图3），而在尖孢镰刀菌黄瓜专化型和番茄专化型中，敲除fgb1则促进菌丝生长[10，13]。
尽管关于fgb1基因在尖孢镰刀菌黄瓜专化型和番茄专化型菌株中的功能已有所阐明，但fgb1敲除突变体是否能侵入根系维管束仍是未知。笔者采用gfp和潮霉素抗性hph基因，通过DNA同源重组替换fgb1基因（图2），所得的fgb1基因敲除突变体携带gfp基因，因此可用荧光显微镜观察突变体在香蕉植株中的侵染和定殖情况。通过用激光共聚焦显微镜观察fgb1突变体在巴西蕉根系中的定殖，笔者发现其可穿透根系皮层和进入维管束木质部，并在其中定殖（图5）。这与以GFP标记的野生型菌株在巴西蕉根系中的侵染定殖方式相似[18]。与此不同，Inoue等[19]研究发现，破坏Fow1基因导致突变体菌株对西甜瓜的致病性显著降低，突变体菌株只能穿透西甜瓜根系表皮，而不能侵入维管束。Kim等[20]发现，破坏尖孢镰刀菌蛋白激酶A编码基因FoCPKA导致突变体菌株不能侵入拟南芥根系维管束。因此，可推测G蛋白β亚基FGB1调控尖孢镰刀菌的致病性可能是通过采用不同于Fow1和FoCPKA的信号途径。此外，与野生型菌株相比，fgb1基因突变体致病力虽然显著减弱，但是其仍然能侵入香蕉根系木质部维管束，笔者推测这可能是由于fgb1基因敲除突变体在侵染香蕉根系的过程中受到宿主的防御，其侵染性生长受一定程度的限制，但仍然能以较慢的速度侵入木质部维管束，其具体机制仍有待进一步研究。
笔者通过构建fgb1基因敲除突变体，分析突变体表型，发现FGB1可调控尖孢镰刀菌古巴专化型菌丝的生长、发育和致病性，其调控尖孢镰刀菌古巴专化型的致病性可能是通过采用不同于Fow1 和蛋白激酶A（FoCPKA）的信号途径。本研究结果为进一步研究G蛋白信号传导途径在尖孢镰刀菌古巴专化型致病过程中的作用奠定了基础。
参考文献
[1] Michielse C B， Rep M. Pathogen profile update： Fusarium oxysporum[J]. Molecular Plant Pathology， 2009， 10（3）： 311-324.
[2] Michielse C B， van Wijk R， Reijnen L， et al. Insight into the molecular requirements for pathogenicity of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici through large-scale insertional mutagenesis[J]. Genome Biology， 2009， 10（1）： R4.
[3] Pietro A D， Madrid M P， Caracuel Z， et al. Fusarium oxysporum： exploring the molecular arsenal of a vascular wilt fungus[J]. Molecular Plant Pathology， 2003， 4（5）： 315-325. [4] 李敏慧， 庄楚雄， 姜子德. 香蕉枯萎病菌4号生理小种致病相关基因foABC1的分离[J]. 菌物研究， 2006， 4（3）： 94-95.
[5]吴飞宏， 曾 涛， 陈汉清， 等. 尖镰孢古巴专化型4号小种T-DNA插入突变体Focr4-1562及其基因敲除子的生物学表型研究[J]. 菌物学报， 2012， 31（4）： 584-592.
[6]蒋艳琴， 曾 涛， 陈汉清， 等. 尖镰孢古巴专化型Focr4-1701突变体的生物学表型研究[J]. 基因组学与应用生物学， 2013， 32（3）： 339-346.
[7] Li M H， Xie X L， Lin X F， et al. Functional characterization of the gene FoOCH1 encoding a putative α-1，6-mannosyltransferase in Fusarium oxysporum f. sp. cubense[J]. Fungal Genetics and Biology， 2014， 65： 1-13.
[8] Qi X Z， Guo L J， Yang L Y， et al. Foatf1， a bZIP transcription factor of Fusarium oxysporum f. sp. cubense， is involved in pathogenesis by regulating the oxidative stress responses of Cavendish banana（Musa spp.）[J]. Physiological and Molecular Plant Pathology， 2013， 84：76-85.
[9] Li L D， Wright S J， Krystofova S， et al. Heterotrimeric G protein signaling in filamentous fungi[J]. Annual Review of Microbiology， 2007， 61（1）： 423-452.
[10] Jain S， Akiyama K， Kan T， et al. The G protein β subunit FGB1 regulates development and pathogenicity in Fusarium oxysporum[J]. Current Genetics， 2003， 43（2）： 79-86.
[11] Jain S， Akiyama K， Mae K， et al. Targeted disruption of a G protein α subunit gene results in reduced pathogenicity in Fusarium oxysporum[J]. Current Genetics， 2002， 41（6）： 407-413.
[12] Jain S， Akiyama K， Takata R， et al. Signaling via the G protein α subunit FGA2 is necessary for pathogenesis in Fusarium oxysporum[J]. FEMS Microbiology Letters， 2005， 243（1）： 165-172.
[13] Delgado-Jarana J， Martinez-Rocha A L， Roldan-Rodriguez R， et al. Fusarium oxysporum G-protein β subunit Fgb1 regulates hyphal growth， development， and virulence through multiple signalling pathways[J]. Fungal Genetics and Biology， 2005， 42（1）： 61-72.
[14] 郭立佳， 彭 军， 杨腊英， 等. 大蕉枯萎病病原菌的分离、鉴定和致病性测定[J]. 热带作物学报， 2013， 34（1）： 105-110.
[15]郭立佳， 黄俊生， 王国芬， 等. 香蕉黑腐病菌（Botryodiplodia theobromae）的PCR检测[J]. 植物病理学报， 2007， 37（3）： 248-254.
[16]谢德啸， 羊玉花， 周端咏， 等. 尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种红色荧光蛋白基因转化[J]. 热带作物学报， 2012， 33（4）： 685-689.
[17] Hamm H E. The many faces of G protein signaling[J]. The Journal of Biological Chemistry， 1998， 273（2）： 669-672.
[18] 郭立佳， 梁昌聪， 张建华， 等. 香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种菌株侵染和定殖巴西蕉和粉蕉根系的观察[J]. 热带作物学报， 2013， 34（11）： 2 262-2 266.
[19] Inoue I， Namiki F， Tsuge T. Plant colonization by the vascular wilt fungus Fusarium oxysporum requires FOW1， a gene encoding a mitochondrial protein[J]. The Plant Cell， 2002， 14（8）： 1 869-1 883.
[20] Kim H S， Park S Y， Lee S， et al. Loss of cAMP-dependent protein kinase A affects multiple traits important for root pathogenesis by Fusarium oxysporum[J]. Molecular Plant-microbe Interactions， 2011， 24（6）： 719-732.