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摘要 水蛭（蚂蝗）是一种重要的中药材，其唾腺分泌的水蛭素具有抗凝血作用，被广泛应用于医疗手术和心血管疾病治疗，具有较高的医疗价值与经济价值。水蛭肠道微生物与水蛭的消化、营养、免疫和抗菌等功能密切相关，也可能与水蛭素的分泌有关。对水蛭肠道微生物的研究方法、菌群组成及作用等方面的研究进展进行了综述，以期为水蛭肠道微生物的深入研究和利用提供理论和方法参考，为推动水蛭养殖业发展和扩展水蛭和水蛭素的医学应用提供理论基础。
关键词 水蛭；肠道微生物；研究方法
中图分类号 S917.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）15-164-03
The Research Progress of Leech Gut Microbes
CHEN Yali1 ， WANG Guihu2， ZHANG Quanxing1 et al
（1. Shaanxi Normal University， Xi’an， Shaanxi 710062； 2. National Local Joint Engineering Research Center of Biodiagnostics & Biotherapy， Xi’an Jiao Tong University， Xi’an， Shaanxi 710004）
Abstract Leech is a traditional Chinese medicine with great importance， its salivary gland secretion hirudin has been widely used into medical surgery， therefore， has a very high economic value. Microbes dwell in leech gut have several functions， such as synthesizing the necessary nutrients for their hosts， stimulating the immune system， and defensing the extraneous pathogens， closely related to the secretion of hirudin and the health of leech. In this research， a review of the study methods， composition and activity of the microbe communities dwell in the Leech gut was given， in order to provide some theoretical and methodological guidance for the further study of gut microbiota in leech， setting theoretical basis for the development of the leech aquaculture industry and for the further expansions of the medical application of hirudin and leech.
Key words Leech； Gut microbes； Research method
動物肠道内栖息着大量的微生物，经过长期共同进化，最终形成复杂且呈动态平衡的微生物群落。大量研究表明，这些消化道内的微生物对宿主健康有极其重要的意义，如果微生态平衡失调，机体正常的生理功能便会紊乱，引发疾病[1]。动物的食性选择和觅食行为也是经历长期而复杂的选择压力的进化结果[2]，动物自身缺失合成某些营养物质的能力，导致其必须依赖体内的共生菌来完成相应功能，比如帮助宿主从食物中进一步摄取营养物质，合成一些关键代谢反应的化合物[3]。因此，动物肠道微生物对宿主的影响及其与疾病等的联系已成为近年来研究的热点问题[4-6]。
水蛭（Leech）隶属环节动物门、蛭纲，俗称蚂蟥。目前全世界已报道的水蛭共有300多种[7]，我国已知2目8科33属约76种和亚种，广泛分布于我国大部分地区[8]。绝大多数水蛭靠吸血生存，吸血水蛭每次摄取血液的量相当于其自身体重的2.5～10.0倍，吸食1次血液可维持长达1年的生存需求[7]。此过程中，水蛭前端的吸盘将刺吸性口器刺入皮肤，其咽头和食道外侧分布的大量唾液腺能分泌具有阻止血液凝固的抗凝剂水蛭素（Hirudin）、麻醉剂以及能使血管寄主扩张的类组胺（Histamine）物质，这类物质能够促使伤口血流量增大，抗凝剂能阻止摄入水蛭消化道内的血液凝固。在此过程中，肠道微生物也起着重要的作用，如合成必要的营养物质、刺激免疫系统和抵抗外来致病菌的侵袭等[9]。水蛭素具有很好的抗凝血、抗血栓和抗纤维化等作用[10]，在当今的医疗领域中不仅应用于术后缓解静脉充血，而且广泛应用于整形外科手术中，提高了手术的成功率[11]。
传统的肠道微生物的分离大多采用培养方法，但绝大多数肠道微生物因为无法培养而未能进行研究和鉴定。随着新的分子生物学技术在肠道微生物研究中的不断应用，尤其是一些分子生物学方法（如末端限制性片段长度多态性（Terminalrestriction fragment length polymorphism，TRFLP）和荧光原位杂交（Fluorescent in situ hybridization，FISH）等）的应用，使研究中对培养方法的依赖大大降低。这些方法能够将难以培养以及不能培养的微生物直接进行分子鉴定，对于全面了解肠道微生物的组成、分布及其功能有很大的帮助。笔者对水蛭肠道微生物的研究方法、肠道微生物的菌群组成以及肠道微生物的作用等方面进行了综述，以期为推动水蛭肠道微生物的研究提供理论及方法参考。 1 水蛭肠道的结构
水蛭肠道依据形态和功能可分为前肠、中肠和后肠。前肠由咽和食管组成，主要功能是摄取寄主血液（体液）；中肠由嗉囊和嗉囊盲囊组成，主要功能是贮藏食物（寄主血液）。大多数水蛭的嗉囊有1～12对向两侧伸展的盲囊，其中最后1对最长并且弯向身体的后方。嗉囊是在水蛭摄食后储存血液的主要区域，可以吸收血液中的水和盐；后肠由肠和直肠组成。肠可以是1根宽阔的纵管，也可以是具有4对细长的侧盲囊，对血液的消化和吸收在此进行。肠的后端通过一括约肌开口在一短而薄壁的直肠上[8]。
2 水蛭肠道微生物的研究方法
2.1 传统分类鉴定方法
由于肠道微生物个体小、种类多、结构简单，形态特征上很难区分。以前肠道微生物的研究主要采用微生物分离培养技术，分为直接观察法和纯培养法。在水蛭肠道微生物的研究中主要采用的是纯培养法，即使用不同营养成分的固体培养基对可培养的微生物进行分离培养，然后根据微生物的菌落形态及其菌落数来计测微生物的数量及其类型，若要得到种类信息，则需进一步地分离、纯化和鉴定[12]。人工培养所能获得的只有自然环境中很小部分的微生物（0.10%～0.15%），大多数微生物种类由于不能在普通培养基上生长而不能被检出，一些形态和生化指标也易受到操作方法和判断主观性影响，从而影响到鉴定结果的准确性[13]。
2.2 分子生物方法
20世纪60年代，随着分子技术的发展，越来越多的生物学技术应用到水蛭肠道微生物的研究中来。新的方法大大地降低了对微生物培养的依赖性，能将肠道中无法培养以及难以培养的细菌分离出来，因此广泛应用于微生物群落结构分析。水蛭肠道微生物研究中较常用的分子生物学技术主要有荧光原位杂交技术、末端限制性片段长多态性和宏基因组技术等[14]。
末端限制性片段长度多态性技术可以分析样品中微生物的组成和不同微生物的種属关系，从而进行各种微生物群落之间比较群落的多样性、结构特征等方面的研究。目前，TRFLP 技术已被广泛用于分析各种环境中（如肠道和土壤等）某类微生物的群落结构[15-16]，其原理是采用一端荧光标记的引物进行PCR，扩增全长16S rRNA 基因，然后用合适的限制性内切酶消化 PCR产物，由于不同菌的16S rRNA 基因序列存在差异，因此酶切后会产生不同长度特征的限制性片段[17]。该技术具有快速、重复性高、灵敏、高通量等优点，其缺点是由于 PCR 扩增存在偏好性，即使使用通用引物，也有可能忽略微生物生态群落中某些功能重要但数量稀少的细菌[18]。
荧光原位杂交技术是20世纪80年代末在已有放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传学技术，根据核酸碱基互补配对原理，用半抗原标记DNA或者RNA探针与经过变性的单链核酸序列互补配对，通过带有荧光基团的抗体去识别半抗原进行检测，或者用荧光基团对探针进行直接标记并与目标序列结合，最后利用荧光显微镜直接观察目标序列在细胞核、染色体或切片组织中的分布情况[19]。荧光原位杂交具有安全、快速、灵敏度高、检测信号强和杂交特异性高等优点，目前已广泛应用于细胞遗传学、 肿瘤生物学、基因定位、基因作图、基因扩增、产前诊断及染色体进化研究等领域[20] 。
2.3 宏基因组技术
宏基因组学（Metagenomics）是指在特定环境样品中基因组的总和，宏基因组学显著的特征包括非传统培养方法获得环境微生物基因组，所获得的基因包含可培养的不能培养的微生物的总基因，从而避免了微生物分离培养的难题，能最大限度地挖掘微生物资源，并研究其功能和彼此之间的关系和相互作用，从而揭示其内在规律[21]。宏基因组学研究策略包括宏基因组DNA的提取、宏基因组测序样品及DNA提取、宏基因组测序和宏基因组文库的制备[22]。宏基因组学技术克服了传统培养方法的限制，在微生物多样性、新基因发现及新生物活性物质等方面展现出了前所未有的魅力，现已被已泛应用于农业、林业、土壤、海洋、人体医学和药物等各个领域[23]。
3 水蛭肠道微生物的菌群组成及作用
3.1 水蛭肠道微生物菌群
水蛭肠道的微生物对于摄取的血食的消化有重要关系。以前以培养为基础的研究认为，医蛭肠道内的微生物主要是气单胞菌属（Aeromonas），而且该属是水蛭消化道里唯一的共生体[24]。随着分子生物学技术的发展，越来越多的方法和技术被应用到肠道微生物的研究中。Paul 等通过末端限制性片段长度多态性研究了侧纹医蛭（Hirudo verbana）肠道微生物，证实了侧纹医蛭肠道细菌群体的主导菌是维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）和clone PW3。其中，clone PW3属于理研菌科（Rikenellaceae）的新种。此外，在肠道中还检测到细菌有α变形菌门、γ变形菌门、δ变形菌门（Proteobacteria）、梭杆菌门（Fusobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）[15]。Alison等运用培养和非培养的限制性片段长多态性的方法研究东方医蛭（Hirudo orientalis）的消化道微生物，结果证实在消化道中的细菌有维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）、简达气单胞菌（Aeromonas jandaei）、类似于理研菌属（Rikenella）的菌和脱硫弧菌属（Desulfovibrio）[25]。随着研究技术的进一步发展，近年来有学者将宏基因技术应用到水蛭肠道微生物的研究中。Michele A.Maltz等应用宏基因组的高通量测序进一步对水蛭肠道微生物菌群进行了探究，结果表明消化道内的主要的共生体是：类似于理研菌属（Rikenella）的菌、维氏气单胞菌（Aeromonas.veronii）和变形杆菌属（Proteus）。此外，检测到的细菌有梭菌属（Clostridium）、脱硫弧菌属（Desulfovibrio）和梭杆菌属（Fusobacterium）[26]。 3.2 水蛭腸道微生物的作用
高通量测序技术的发展促进了对大多数不能培养的细菌生理特性、代谢功能及在环境中的作用的研究，采用转录组测序技术研究医蛭肠道微生物的特性[27]。在一些水蛭肠道中发现维氏气单胞菌是革兰氏阴性的兼性厌氧菌，并且许多气单胞菌属的菌已经鉴定为人以及一些动物包括鱼和两栖类的致病菌[28]，能够引起伤口感染和败血症等，预防性的抗生素能够减少感染的发病率[29]。最近的研究热点是探究水蛭肠道微生物菌群与抗菌素的敏感性[30]。
关于水蛭肠道微生物的相关功能，早期的研究者认为肠道微生物有3个主要功能：①辅助血食的消化；②提供必要的营养物质；③抵抗外来致病菌的侵袭[31]。随后的许多研究表明在肠道里存在宿主产生的蛋白酶，在消化时细菌产生的蛋白酶可能有重要的作用[32]。在后期的研究中发现水蛭所摄食的血液的消化与肠道的微生物的关系可能是提供抵抗外来有害或致病菌的侵入，特定的肠道微生物能够为消化摄取的血液提供最佳的营养环境[33]。
4 展望
目前，尽管通过传统培养与非培养的方法在水蛭肠道微生物的研究中取得了一些进展，但肠道微生物与宿主之间的作用机制以及与水蛭素的分泌、水蛭素的质量及保存中的作用等问题研究较少。由于水蛭素在医学上具有举足轻重的作用，因此水蛭肠道微生物的功能和作用机制的研究是今后研究的方向。深入了解水蛭肠道微生物群落组成和功能以及肠道微生物对水蛭素的影响机制，对于医疗以及相关肠道疾病的研究都有重要的意义。
参考文献
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关键词 水蛭；肠道微生物；研究方法
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The Research Progress of Leech Gut Microbes
CHEN Yali1 ， WANG Guihu2， ZHANG Quanxing1 et al
（1. Shaanxi Normal University， Xi’an， Shaanxi 710062； 2. National Local Joint Engineering Research Center of Biodiagnostics & Biotherapy， Xi’an Jiao Tong University， Xi’an， Shaanxi 710004）
Abstract Leech is a traditional Chinese medicine with great importance， its salivary gland secretion hirudin has been widely used into medical surgery， therefore， has a very high economic value. Microbes dwell in leech gut have several functions， such as synthesizing the necessary nutrients for their hosts， stimulating the immune system， and defensing the extraneous pathogens， closely related to the secretion of hirudin and the health of leech. In this research， a review of the study methods， composition and activity of the microbe communities dwell in the Leech gut was given， in order to provide some theoretical and methodological guidance for the further study of gut microbiota in leech， setting theoretical basis for the development of the leech aquaculture industry and for the further expansions of the medical application of hirudin and leech.
Key words Leech； Gut microbes； Research method
動物肠道内栖息着大量的微生物，经过长期共同进化，最终形成复杂且呈动态平衡的微生物群落。大量研究表明，这些消化道内的微生物对宿主健康有极其重要的意义，如果微生态平衡失调，机体正常的生理功能便会紊乱，引发疾病[1]。动物的食性选择和觅食行为也是经历长期而复杂的选择压力的进化结果[2]，动物自身缺失合成某些营养物质的能力，导致其必须依赖体内的共生菌来完成相应功能，比如帮助宿主从食物中进一步摄取营养物质，合成一些关键代谢反应的化合物[3]。因此，动物肠道微生物对宿主的影响及其与疾病等的联系已成为近年来研究的热点问题[4-6]。
水蛭（Leech）隶属环节动物门、蛭纲，俗称蚂蟥。目前全世界已报道的水蛭共有300多种[7]，我国已知2目8科33属约76种和亚种，广泛分布于我国大部分地区[8]。绝大多数水蛭靠吸血生存，吸血水蛭每次摄取血液的量相当于其自身体重的2.5～10.0倍，吸食1次血液可维持长达1年的生存需求[7]。此过程中，水蛭前端的吸盘将刺吸性口器刺入皮肤，其咽头和食道外侧分布的大量唾液腺能分泌具有阻止血液凝固的抗凝剂水蛭素（Hirudin）、麻醉剂以及能使血管寄主扩张的类组胺（Histamine）物质，这类物质能够促使伤口血流量增大，抗凝剂能阻止摄入水蛭消化道内的血液凝固。在此过程中，肠道微生物也起着重要的作用，如合成必要的营养物质、刺激免疫系统和抵抗外来致病菌的侵袭等[9]。水蛭素具有很好的抗凝血、抗血栓和抗纤维化等作用[10]，在当今的医疗领域中不仅应用于术后缓解静脉充血，而且广泛应用于整形外科手术中，提高了手术的成功率[11]。
传统的肠道微生物的分离大多采用培养方法，但绝大多数肠道微生物因为无法培养而未能进行研究和鉴定。随着新的分子生物学技术在肠道微生物研究中的不断应用，尤其是一些分子生物学方法（如末端限制性片段长度多态性（Terminalrestriction fragment length polymorphism，TRFLP）和荧光原位杂交（Fluorescent in situ hybridization，FISH）等）的应用，使研究中对培养方法的依赖大大降低。这些方法能够将难以培养以及不能培养的微生物直接进行分子鉴定，对于全面了解肠道微生物的组成、分布及其功能有很大的帮助。笔者对水蛭肠道微生物的研究方法、肠道微生物的菌群组成以及肠道微生物的作用等方面进行了综述，以期为推动水蛭肠道微生物的研究提供理论及方法参考。 1 水蛭肠道的结构
水蛭肠道依据形态和功能可分为前肠、中肠和后肠。前肠由咽和食管组成，主要功能是摄取寄主血液（体液）；中肠由嗉囊和嗉囊盲囊组成，主要功能是贮藏食物（寄主血液）。大多数水蛭的嗉囊有1～12对向两侧伸展的盲囊，其中最后1对最长并且弯向身体的后方。嗉囊是在水蛭摄食后储存血液的主要区域，可以吸收血液中的水和盐；后肠由肠和直肠组成。肠可以是1根宽阔的纵管，也可以是具有4对细长的侧盲囊，对血液的消化和吸收在此进行。肠的后端通过一括约肌开口在一短而薄壁的直肠上[8]。
2 水蛭肠道微生物的研究方法
2.1 传统分类鉴定方法
由于肠道微生物个体小、种类多、结构简单，形态特征上很难区分。以前肠道微生物的研究主要采用微生物分离培养技术，分为直接观察法和纯培养法。在水蛭肠道微生物的研究中主要采用的是纯培养法，即使用不同营养成分的固体培养基对可培养的微生物进行分离培养，然后根据微生物的菌落形态及其菌落数来计测微生物的数量及其类型，若要得到种类信息，则需进一步地分离、纯化和鉴定[12]。人工培养所能获得的只有自然环境中很小部分的微生物（0.10%～0.15%），大多数微生物种类由于不能在普通培养基上生长而不能被检出，一些形态和生化指标也易受到操作方法和判断主观性影响，从而影响到鉴定结果的准确性[13]。
2.2 分子生物方法
20世纪60年代，随着分子技术的发展，越来越多的生物学技术应用到水蛭肠道微生物的研究中来。新的方法大大地降低了对微生物培养的依赖性，能将肠道中无法培养以及难以培养的细菌分离出来，因此广泛应用于微生物群落结构分析。水蛭肠道微生物研究中较常用的分子生物学技术主要有荧光原位杂交技术、末端限制性片段长多态性和宏基因组技术等[14]。
末端限制性片段长度多态性技术可以分析样品中微生物的组成和不同微生物的種属关系，从而进行各种微生物群落之间比较群落的多样性、结构特征等方面的研究。目前，TRFLP 技术已被广泛用于分析各种环境中（如肠道和土壤等）某类微生物的群落结构[15-16]，其原理是采用一端荧光标记的引物进行PCR，扩增全长16S rRNA 基因，然后用合适的限制性内切酶消化 PCR产物，由于不同菌的16S rRNA 基因序列存在差异，因此酶切后会产生不同长度特征的限制性片段[17]。该技术具有快速、重复性高、灵敏、高通量等优点，其缺点是由于 PCR 扩增存在偏好性，即使使用通用引物，也有可能忽略微生物生态群落中某些功能重要但数量稀少的细菌[18]。
荧光原位杂交技术是20世纪80年代末在已有放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传学技术，根据核酸碱基互补配对原理，用半抗原标记DNA或者RNA探针与经过变性的单链核酸序列互补配对，通过带有荧光基团的抗体去识别半抗原进行检测，或者用荧光基团对探针进行直接标记并与目标序列结合，最后利用荧光显微镜直接观察目标序列在细胞核、染色体或切片组织中的分布情况[19]。荧光原位杂交具有安全、快速、灵敏度高、检测信号强和杂交特异性高等优点，目前已广泛应用于细胞遗传学、 肿瘤生物学、基因定位、基因作图、基因扩增、产前诊断及染色体进化研究等领域[20] 。
2.3 宏基因组技术
宏基因组学（Metagenomics）是指在特定环境样品中基因组的总和，宏基因组学显著的特征包括非传统培养方法获得环境微生物基因组，所获得的基因包含可培养的不能培养的微生物的总基因，从而避免了微生物分离培养的难题，能最大限度地挖掘微生物资源，并研究其功能和彼此之间的关系和相互作用，从而揭示其内在规律[21]。宏基因组学研究策略包括宏基因组DNA的提取、宏基因组测序样品及DNA提取、宏基因组测序和宏基因组文库的制备[22]。宏基因组学技术克服了传统培养方法的限制，在微生物多样性、新基因发现及新生物活性物质等方面展现出了前所未有的魅力，现已被已泛应用于农业、林业、土壤、海洋、人体医学和药物等各个领域[23]。
3 水蛭肠道微生物的菌群组成及作用
3.1 水蛭肠道微生物菌群
水蛭肠道的微生物对于摄取的血食的消化有重要关系。以前以培养为基础的研究认为，医蛭肠道内的微生物主要是气单胞菌属（Aeromonas），而且该属是水蛭消化道里唯一的共生体[24]。随着分子生物学技术的发展，越来越多的方法和技术被应用到肠道微生物的研究中。Paul 等通过末端限制性片段长度多态性研究了侧纹医蛭（Hirudo verbana）肠道微生物，证实了侧纹医蛭肠道细菌群体的主导菌是维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）和clone PW3。其中，clone PW3属于理研菌科（Rikenellaceae）的新种。此外，在肠道中还检测到细菌有α变形菌门、γ变形菌门、δ变形菌门（Proteobacteria）、梭杆菌门（Fusobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）[15]。Alison等运用培养和非培养的限制性片段长多态性的方法研究东方医蛭（Hirudo orientalis）的消化道微生物，结果证实在消化道中的细菌有维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）、简达气单胞菌（Aeromonas jandaei）、类似于理研菌属（Rikenella）的菌和脱硫弧菌属（Desulfovibrio）[25]。随着研究技术的进一步发展，近年来有学者将宏基因技术应用到水蛭肠道微生物的研究中。Michele A.Maltz等应用宏基因组的高通量测序进一步对水蛭肠道微生物菌群进行了探究，结果表明消化道内的主要的共生体是：类似于理研菌属（Rikenella）的菌、维氏气单胞菌（Aeromonas.veronii）和变形杆菌属（Proteus）。此外，检测到的细菌有梭菌属（Clostridium）、脱硫弧菌属（Desulfovibrio）和梭杆菌属（Fusobacterium）[26]。 3.2 水蛭腸道微生物的作用
高通量测序技术的发展促进了对大多数不能培养的细菌生理特性、代谢功能及在环境中的作用的研究，采用转录组测序技术研究医蛭肠道微生物的特性[27]。在一些水蛭肠道中发现维氏气单胞菌是革兰氏阴性的兼性厌氧菌，并且许多气单胞菌属的菌已经鉴定为人以及一些动物包括鱼和两栖类的致病菌[28]，能够引起伤口感染和败血症等，预防性的抗生素能够减少感染的发病率[29]。最近的研究热点是探究水蛭肠道微生物菌群与抗菌素的敏感性[30]。
关于水蛭肠道微生物的相关功能，早期的研究者认为肠道微生物有3个主要功能：①辅助血食的消化；②提供必要的营养物质；③抵抗外来致病菌的侵袭[31]。随后的许多研究表明在肠道里存在宿主产生的蛋白酶，在消化时细菌产生的蛋白酶可能有重要的作用[32]。在后期的研究中发现水蛭所摄食的血液的消化与肠道的微生物的关系可能是提供抵抗外来有害或致病菌的侵入，特定的肠道微生物能够为消化摄取的血液提供最佳的营养环境[33]。
4 展望
目前，尽管通过传统培养与非培养的方法在水蛭肠道微生物的研究中取得了一些进展，但肠道微生物与宿主之间的作用机制以及与水蛭素的分泌、水蛭素的质量及保存中的作用等问题研究较少。由于水蛭素在医学上具有举足轻重的作用，因此水蛭肠道微生物的功能和作用机制的研究是今后研究的方向。深入了解水蛭肠道微生物群落组成和功能以及肠道微生物对水蛭素的影响机制，对于医疗以及相关肠道疾病的研究都有重要的意义。
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