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摘要 概述了低温胁迫下寒害冻害导致的香蕉形态结构与生理生化变化，以及细胞工程、抗寒基因工程方面的研究进展，以供参考。
关键词 香蕉；冻害；寒害；生理生化；抗寒细胞工程；抗寒基因工程；研究进展
中图分类号 S663 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）04-0057-02
香蕉是芭蕉科（Musaceae）芭蕉属（Musa）植物，是世界第二大水果和第四大粮食作物，全球共有136个国家和地区种植。我国香蕉主要分布于广东、广西、福建、海南、云南等省，贵州、四川等地也有少量栽培。寒害、冻害是影响我国香蕉生产最主要的自然灾害之一，轻则株残减产，重则株死失收。寒害、冻害对香蕉影响的研究，首先是其形態结构变化的一般性描述，其次是其生理生化变化和生理调节机制，然后发展到细胞分子水平。
1 寒害冻害对香蕉形态结构的影响
1.1 形态的变化
低温胁迫下，香蕉叶片最易遭受低温寒害，首先转黄，出现水渍状斑点；然后逐渐转变为黑褐色，软化枯死；若温度进一步降低产生冻害，香蕉叶柄及假茎则出现浓黄褐色水渍斑，直至腐烂死亡。这些表观症状是判断香蕉是否受到寒害冻害影响的最直观的参考指标。林日荣、凌兴汉、Shmueli E.等有关于香蕉植株冷害症状的观察报告[1-3]。雷朝云等[4]根据香蕉叶片和假茎受害程度，将香蕉寒害依次划分等级。
1.2 叶片组织结构的变化
Shmueli E.等报道了冷害对叶片组织结构的影响，并从香蕉叶片组织结构及其蒸腾特点等方面研究香蕉的冷害机理。国内也有研究报道，香蕉叶片组织细胞结构紧密度（CCTR或CTR）和疏松度（SR或PR）与其抗寒力有关，紧密度越大，疏松度越小，则抗寒力越强，并得出与实际相符的抗寒力大小顺序，具有品种特异性和稳定性[5-7]。
2 寒害、冻害对香蕉生理生化的影响
2.1 相对电导率
受低温等逆境胁迫时，植物细胞原生质膜结构被破坏，细胞膜的选择透性改变或丧失，导致细胞内物质大量外渗，外渗物质中约20%是K ，80%是葡萄糖、氨基酸及低聚糖类等[8]。因此，可通过测定香蕉细胞组织浸出液的电导率，推测其耐寒能力[9]。一般使用相对电导率[6，10-11]来衡量香蕉的耐寒力，电导率越大，耐寒力越弱。相对电导率法测定的耐寒力程度与其田间表现吻合。
2.2 丙二醛（MDA）含量
逆境胁迫会引发或加剧植物膜脂过氧化反应。膜脂过氧化产生的中间产物自由基和最终产物丙二醛（MDA）都会对生物膜造成严重的损伤[12]，降低膜脂流动性，增大质膜透性[13-14]。测定丙二醛含量可以评价质膜受损程度。丙二醛的含量与植物抗寒能力的大小呈反相关，丙二醛含量越高，植物的抗寒性越弱，反之，则越强。越冬期间香蕉植株内MDA含量呈上升趋势，台湾蕉MDA含量明显高于柴蕉[15]。在越冬期，经多效唑（PP333）、脱落酸（ABA）、氯化胆碱（CC）等处理[15-17]，香蕉MDA含量均明显下降，一定程度上提高了香蕉的抗寒性。
2.3 酶活性
逆境胁迫下植物出现的伤害可能涉及到活性氧的毒害作用，植物体通过酶促和非酶促2类防御系统来保护其机体免受伤害[18-19]。SOD、POD、CAT等保护酶都属于活性氧清除剂，测定这几种酶的活力可以评价机体受活性氧毒害程度。植物体内所含的SOD、POD、CAT等越多，越能有效地清除植物体内活性氧的积累，则由活性氧引起的伤害就越小，耐寒力就越强。越冬期间低温胁迫引起香蕉保护酶SOD、CAT、POD活性呈下降趋势，其中香蕉保护酶（SOD、CAT、POD）的活性下降幅度比柴蕉大[15，20]，且它们的变化与幼苗抗冷性的提高存在着明显的相关性[21-22]。抗坏血酸（ASA）、谷胱甘肽（GSH）等属于非酶系统。香蕉在冷害过程中，叶片中抗坏血酸含量明显下降，大蕉叶片中的抗坏血酸含量一直高于香蕉且降幅很小[22]。生产上通过喷施多效唑（PP333）[20，23]、甜菜碱（BT）和壳聚糖（CTS）[24-25]、氯化胆碱（CC）[17]、水杨酸（SA）[26-27]、过氧化氢（H2O2）[28]、Ca2 [29]、硝酸镧[10]可以提高香蕉保护酶SOD、POD和CAT的活性，降低叶片细胞的膜脂过氧化程度，降低质膜透性等增强香蕉的抗冷性。
3 抗寒细胞工程方面的研究进展
3.1 原生质体培养
以单个原生质体进行准确的遗传操作，易于进行转化体的筛选和分析，避免嵌合现象；转化后形成的愈伤组织可进行早期筛选且再生植株往往是纯合体，且在遗传上易稳定。原生质体作为受体系统进行遗传操作广泛应用于植物遗传转化研究。最早是Bakry[30]从香蕉花序愈伤组织中成功分离出活的原生质体。Cronauer等[31-33]也进行了关于获得原生质体的报道，但是产量很低且不能进行细胞分裂。Assani等[34]认为由叶肉细胞和愈伤组织起源的原生质体无法分裂，而细胞悬浮系起源的原生质体产量最高、可再生成完整植株；Megia等[35]和Panis等[36]由煮食蕉“Bluggoe”（ABB）多芽体途径诱导获得的优良胚性悬浮细胞系制备高质量的原生质体，采用高密度培养及看护培养方法，通过胚状体发生方式直接形成完整植株，是香蕉原生质体分离和培养的重要进步。Matsumoto、肖望、Assani等同样应用看护培养方法成功获得香蕉再生植株[34，37-41]。目前，成功进行原生质体培养的香蕉品种共有12个（AA、AAB、ABB、BB），为香蕉体细胞杂交和基因转化提供新途径。
3.2 体细胞杂交
野生香蕉（AA、BB、AB）或大蕉类（AAB、ABB）存在抗病、抗寒等抗逆性基因，现有主栽品种（AAA、ABB、BBB等）存在与品质有关的某些优良基因或抗性基因。可以通过原生质体融合进行体细胞杂交获得杂种细胞，再用低温条件筛选出抗寒细胞系，然后对其进行培养诱导，分化出新的抗寒株系。此项技术在一定程度上克服了香蕉有性杂交困难的问题，而且在转移多基因控制的性状方面具有明显的优势。Matsumoto等[42]采用电融合法融合了香蕉品种cv.Musa（AAB）和野生蕉cv.LiDi（AA）的原生质体，培养获得不同倍性的再生植株，但是存在频率较低、且重复性较差的缺点。肖 望等[38-39]采用不对称融合法，获得了龙牙蕉和贡蕉的融合再生株。但香蕉的原生质体融合技术尚处于探索阶段。 4 抗寒基因工程的研究进展
植物抗寒性是一个数量性状，受微效多基因控制，是植物长期适应低温环境而形成的一种潜在的遗传特性。抗寒基因是一类诱导型基因，只有受特定条件诱导启动表达后，才表现出抗寒力[43]。香蕉基因工程研究主要集中在抗病方面，抗寒基因研究相对较少。
大多数香蕉栽培品种是三倍体，生长周期长，而且不孕，给繁殖和育种带来一定的困难。遗传转化技术的发展为香蕉品种的改良提供了一种有效的手段。在香蕉的遗传转化中，高效的受体系统和转化方法是外源基因成功导入的基础。从有关报道看，香蕉转基因受体主要为茎尖或茎微盘、悬浮细胞、原生质体和愈伤组织。
当植物受到低温或水分胁迫时，一些抗寒基因的启动子被激活[44]，诱导抗寒调节基因表达，目前已经克隆了许多植物抗寒相关基因[45]。康国章等[26-27]采用mRNA差异显示法区分经SA诱导冷处理的香蕉幼苗与未处理之间的基因差异表达，克隆低温胁迫下SA诱导的显著表达的2条差异带（G和A），并测序发现G片段与大豆在冷胁迫下2个高表达基因片段的部分序列有92%的同源性。Santos[46]分析了香蕉在低温下的表达序列标签。
目前，在香蕉基因转化上取得成功的方法主要有电激法、基因枪法、农杆菌介导法等3种方法。并且在AAA、AAB和ABB基因型香蕉上转化均获得成功，但几乎都是抗病基因的转化。香蕉抗寒基因转化方面研究很少。刘德斌[47]利用根癌农杆菌介导将在BR诱导下低温胁迫的香蕉幼苗中特异表达的香蕉rbcS-mc基因通过叶盘法转化烟草植株。随着分子生物学的发展，出现了转化频率更高、重复性更好的香蕉遗传转化技术，如农杆菌和基因枪结合法、离心辅助农杆菌介导法、真空渗透技术等。这些新技术新方法的出现，必将推动香蕉产业的高速发展。
5 问题与展望
香蕉原产于热带地区，遗传特性决定其抗寒能力较差。虽然在香蕉抗寒生理的研究上取得了很好的成绩，但在抗寒机理（蛋白质、DNA），尤其是分子遗传特性等方面的研究还很少。植物的抗寒性是一种积累性的多基因控制的性状，通过分子技术克隆香蕉的抗寒基因并通过基因工程手段来提高香蕉的抗寒性方面的研究还较少。冷信号如何传递、各种抗寒基因如何发挥抗寒活性等问题尚需深入研究。另外，在进行植物抗寒基因工程研究的同时仍需加强基础研究，寻找抗寒主基因，推动抗寒转基因育种发展。
6 参考文献
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关键词 香蕉；冻害；寒害；生理生化；抗寒细胞工程；抗寒基因工程；研究进展
中图分类号 S663 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）04-0057-02
香蕉是芭蕉科（Musaceae）芭蕉属（Musa）植物，是世界第二大水果和第四大粮食作物，全球共有136个国家和地区种植。我国香蕉主要分布于广东、广西、福建、海南、云南等省，贵州、四川等地也有少量栽培。寒害、冻害是影响我国香蕉生产最主要的自然灾害之一，轻则株残减产，重则株死失收。寒害、冻害对香蕉影响的研究，首先是其形態结构变化的一般性描述，其次是其生理生化变化和生理调节机制，然后发展到细胞分子水平。
1 寒害冻害对香蕉形态结构的影响
1.1 形态的变化
低温胁迫下，香蕉叶片最易遭受低温寒害，首先转黄，出现水渍状斑点；然后逐渐转变为黑褐色，软化枯死；若温度进一步降低产生冻害，香蕉叶柄及假茎则出现浓黄褐色水渍斑，直至腐烂死亡。这些表观症状是判断香蕉是否受到寒害冻害影响的最直观的参考指标。林日荣、凌兴汉、Shmueli E.等有关于香蕉植株冷害症状的观察报告[1-3]。雷朝云等[4]根据香蕉叶片和假茎受害程度，将香蕉寒害依次划分等级。
1.2 叶片组织结构的变化
Shmueli E.等报道了冷害对叶片组织结构的影响，并从香蕉叶片组织结构及其蒸腾特点等方面研究香蕉的冷害机理。国内也有研究报道，香蕉叶片组织细胞结构紧密度（CCTR或CTR）和疏松度（SR或PR）与其抗寒力有关，紧密度越大，疏松度越小，则抗寒力越强，并得出与实际相符的抗寒力大小顺序，具有品种特异性和稳定性[5-7]。
2 寒害、冻害对香蕉生理生化的影响
2.1 相对电导率
受低温等逆境胁迫时，植物细胞原生质膜结构被破坏，细胞膜的选择透性改变或丧失，导致细胞内物质大量外渗，外渗物质中约20%是K ，80%是葡萄糖、氨基酸及低聚糖类等[8]。因此，可通过测定香蕉细胞组织浸出液的电导率，推测其耐寒能力[9]。一般使用相对电导率[6，10-11]来衡量香蕉的耐寒力，电导率越大，耐寒力越弱。相对电导率法测定的耐寒力程度与其田间表现吻合。
2.2 丙二醛（MDA）含量
逆境胁迫会引发或加剧植物膜脂过氧化反应。膜脂过氧化产生的中间产物自由基和最终产物丙二醛（MDA）都会对生物膜造成严重的损伤[12]，降低膜脂流动性，增大质膜透性[13-14]。测定丙二醛含量可以评价质膜受损程度。丙二醛的含量与植物抗寒能力的大小呈反相关，丙二醛含量越高，植物的抗寒性越弱，反之，则越强。越冬期间香蕉植株内MDA含量呈上升趋势，台湾蕉MDA含量明显高于柴蕉[15]。在越冬期，经多效唑（PP333）、脱落酸（ABA）、氯化胆碱（CC）等处理[15-17]，香蕉MDA含量均明显下降，一定程度上提高了香蕉的抗寒性。
2.3 酶活性
逆境胁迫下植物出现的伤害可能涉及到活性氧的毒害作用，植物体通过酶促和非酶促2类防御系统来保护其机体免受伤害[18-19]。SOD、POD、CAT等保护酶都属于活性氧清除剂，测定这几种酶的活力可以评价机体受活性氧毒害程度。植物体内所含的SOD、POD、CAT等越多，越能有效地清除植物体内活性氧的积累，则由活性氧引起的伤害就越小，耐寒力就越强。越冬期间低温胁迫引起香蕉保护酶SOD、CAT、POD活性呈下降趋势，其中香蕉保护酶（SOD、CAT、POD）的活性下降幅度比柴蕉大[15，20]，且它们的变化与幼苗抗冷性的提高存在着明显的相关性[21-22]。抗坏血酸（ASA）、谷胱甘肽（GSH）等属于非酶系统。香蕉在冷害过程中，叶片中抗坏血酸含量明显下降，大蕉叶片中的抗坏血酸含量一直高于香蕉且降幅很小[22]。生产上通过喷施多效唑（PP333）[20，23]、甜菜碱（BT）和壳聚糖（CTS）[24-25]、氯化胆碱（CC）[17]、水杨酸（SA）[26-27]、过氧化氢（H2O2）[28]、Ca2 [29]、硝酸镧[10]可以提高香蕉保护酶SOD、POD和CAT的活性，降低叶片细胞的膜脂过氧化程度，降低质膜透性等增强香蕉的抗冷性。
3 抗寒细胞工程方面的研究进展
3.1 原生质体培养
以单个原生质体进行准确的遗传操作，易于进行转化体的筛选和分析，避免嵌合现象；转化后形成的愈伤组织可进行早期筛选且再生植株往往是纯合体，且在遗传上易稳定。原生质体作为受体系统进行遗传操作广泛应用于植物遗传转化研究。最早是Bakry[30]从香蕉花序愈伤组织中成功分离出活的原生质体。Cronauer等[31-33]也进行了关于获得原生质体的报道，但是产量很低且不能进行细胞分裂。Assani等[34]认为由叶肉细胞和愈伤组织起源的原生质体无法分裂，而细胞悬浮系起源的原生质体产量最高、可再生成完整植株；Megia等[35]和Panis等[36]由煮食蕉“Bluggoe”（ABB）多芽体途径诱导获得的优良胚性悬浮细胞系制备高质量的原生质体，采用高密度培养及看护培养方法，通过胚状体发生方式直接形成完整植株，是香蕉原生质体分离和培养的重要进步。Matsumoto、肖望、Assani等同样应用看护培养方法成功获得香蕉再生植株[34，37-41]。目前，成功进行原生质体培养的香蕉品种共有12个（AA、AAB、ABB、BB），为香蕉体细胞杂交和基因转化提供新途径。
3.2 体细胞杂交
野生香蕉（AA、BB、AB）或大蕉类（AAB、ABB）存在抗病、抗寒等抗逆性基因，现有主栽品种（AAA、ABB、BBB等）存在与品质有关的某些优良基因或抗性基因。可以通过原生质体融合进行体细胞杂交获得杂种细胞，再用低温条件筛选出抗寒细胞系，然后对其进行培养诱导，分化出新的抗寒株系。此项技术在一定程度上克服了香蕉有性杂交困难的问题，而且在转移多基因控制的性状方面具有明显的优势。Matsumoto等[42]采用电融合法融合了香蕉品种cv.Musa（AAB）和野生蕉cv.LiDi（AA）的原生质体，培养获得不同倍性的再生植株，但是存在频率较低、且重复性较差的缺点。肖 望等[38-39]采用不对称融合法，获得了龙牙蕉和贡蕉的融合再生株。但香蕉的原生质体融合技术尚处于探索阶段。 4 抗寒基因工程的研究进展
植物抗寒性是一个数量性状，受微效多基因控制，是植物长期适应低温环境而形成的一种潜在的遗传特性。抗寒基因是一类诱导型基因，只有受特定条件诱导启动表达后，才表现出抗寒力[43]。香蕉基因工程研究主要集中在抗病方面，抗寒基因研究相对较少。
大多数香蕉栽培品种是三倍体，生长周期长，而且不孕，给繁殖和育种带来一定的困难。遗传转化技术的发展为香蕉品种的改良提供了一种有效的手段。在香蕉的遗传转化中，高效的受体系统和转化方法是外源基因成功导入的基础。从有关报道看，香蕉转基因受体主要为茎尖或茎微盘、悬浮细胞、原生质体和愈伤组织。
当植物受到低温或水分胁迫时，一些抗寒基因的启动子被激活[44]，诱导抗寒调节基因表达，目前已经克隆了许多植物抗寒相关基因[45]。康国章等[26-27]采用mRNA差异显示法区分经SA诱导冷处理的香蕉幼苗与未处理之间的基因差异表达，克隆低温胁迫下SA诱导的显著表达的2条差异带（G和A），并测序发现G片段与大豆在冷胁迫下2个高表达基因片段的部分序列有92%的同源性。Santos[46]分析了香蕉在低温下的表达序列标签。
目前，在香蕉基因转化上取得成功的方法主要有电激法、基因枪法、农杆菌介导法等3种方法。并且在AAA、AAB和ABB基因型香蕉上转化均获得成功，但几乎都是抗病基因的转化。香蕉抗寒基因转化方面研究很少。刘德斌[47]利用根癌农杆菌介导将在BR诱导下低温胁迫的香蕉幼苗中特异表达的香蕉rbcS-mc基因通过叶盘法转化烟草植株。随着分子生物学的发展，出现了转化频率更高、重复性更好的香蕉遗传转化技术，如农杆菌和基因枪结合法、离心辅助农杆菌介导法、真空渗透技术等。这些新技术新方法的出现，必将推动香蕉产业的高速发展。
5 问题与展望
香蕉原产于热带地区，遗传特性决定其抗寒能力较差。虽然在香蕉抗寒生理的研究上取得了很好的成绩，但在抗寒机理（蛋白质、DNA），尤其是分子遗传特性等方面的研究还很少。植物的抗寒性是一种积累性的多基因控制的性状，通过分子技术克隆香蕉的抗寒基因并通过基因工程手段来提高香蕉的抗寒性方面的研究还较少。冷信号如何传递、各种抗寒基因如何发挥抗寒活性等问题尚需深入研究。另外，在进行植物抗寒基因工程研究的同时仍需加强基础研究，寻找抗寒主基因，推动抗寒转基因育种发展。
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[1] 林日荣.香蕉[M].广州：广东科学技术出版社，1979.
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