【摘 要】
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目的 检测T7核酸外切酶是否可用于同源重组介导的DNA片段重组克隆技术.方法 利用PCR方法克隆pUC 19片段和卡那霉素供体片段后与T7核酸外切酶混合反应,将反应物直接转化大肠杆
【机 构】
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200433,复旦大学生命科学学院遗传工程国家重点实验室201203,上海近岸生物科技有限公司;吴江近岸蛋白质科技有限公司,215200;上海近岸生物科技有限公司,201203;复旦大学生命科学学院遗
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目的 检测T7核酸外切酶是否可用于同源重组介导的DNA片段重组克隆技术.方法 利用PCR方法克隆pUC 19片段和卡那霉素供体片段后与T7核酸外切酶混合反应,将反应物直接转化大肠杆菌并克隆计数.结果 末端互补的线性化双链DNA分子与T7核酸外切酶反应后,无需纯化,即可直接用于转化大肠杆菌.和其他不依赖于连接酶的克隆法相似,T7核酸外切酶的一步克隆法(T7 exonuclease dependent one-step cloning,EDOC)的效率与末端互补序列的长度成正比,互补序列大于等于10 bp时即可稳定地产生克隆,互补区内的突变不利于同源重组发生.测序结果显示EDOC是一种精确克隆法,并未发现缺失,插入和点突变生成.结论 证实了T7核酸外切酶可被用于重组DNA的精确拼接,并成功建立了依赖于EDOC.
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