【摘 要】
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目的 探讨重组白介素35 (rIL-35)对支气管哮喘(简称哮喘)免疫调节和治疗作用.方法 通过分子克隆技术构建重组质粒pSectag2A-IL-35,测序正确后转染中华仓鼠卵巢细胞(CHO细胞),
【机 构】
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海军军医大学长征医院呼吸与危重症医学科,上海,200003海军军医大学东方肝胆外科医院呼吸科,上海,201805;
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目的 探讨重组白介素35 (rIL-35)对支气管哮喘(简称哮喘)免疫调节和治疗作用.方法 通过分子克隆技术构建重组质粒pSectag2A-IL-35,测序正确后转染中华仓鼠卵巢细胞(CHO细胞),筛选获得稳转株,利用镍柱(NI柱)纯化阳性克隆的培养上清,获得rIL-35蛋白,免疫印迹鉴定.利用卵清白蛋白(OVA)建立小鼠哮喘模型,分为对照组、哮喘组及实验组(rIL-35干预组),后者激发前给予rIL-35蛋白干预,观察其对小鼠哮喘动物模型激发后急性发作、气道炎症的影响.检测各组支气管肺泡灌洗液(BALF)中淋巴细胞、嗜酸粒细胞数目及上清中细胞因子IL-4、IL-17、转化生长因子β (TGF-β)、干扰素γ(IFN-γ)的含量;同时检测肺组织中叉状头转录因子P3 (FoxP3)和IL-17蛋白的表达等.结果 pSectag2A-IL-35表达载体经测序完全正确;将其转染至CHO细胞,筛选出稳定表达IL-35蛋白的CHO-IL-35细胞株,纯化稳转株培养基上清获得的rIL-35蛋白能与HIS标签抗体及p35特异性抗体结合,且目的条带均与IL-35蛋白相对分子质量(45 800)相符;将纯化后的rIL-35蛋白干预哮喘模型小鼠,实验组小鼠BALF中IL-4及IL-17表达量及肺组织中IL-17蛋白明显低于哮喘组,TGF-β、INF-γ则高于后者;BALF及肺组织中炎性细胞的浸润程度显著轻于哮喘组.免疫组织化学结果显示,哮喘组与实验组FoxP3阳性细胞数相仿,均低于对照组,哮喘组的IL-17阳性表达明显高于其余2组.结论 成功构建pSectag2A-IL-35重组真核表达载体,获得稳转株CHO/pSectag2A-IL-35及重组IL-35蛋白,所制备的IL-35蛋白能通过调节Treg/Th17细胞之间的平衡,抑制哮喘气道炎症反应,有望成为免疫治疗的新靶点.
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