论文部分内容阅读
摘要[目的]获得高质量的棉花细胞质雄性不育系线粒体RNA。[方法]以哈克尼西棉细胞质雄性不育系黄化苗为研究对象，对棉花线粒体RNA的提取方法进行探讨。[结果]采取先分离出棉花线粒体再提取RNA的方法，最终获得了质量较好的线粒体RNA（mtRNA）。[结论] 成功获得了质量较高的mtRNA。
关键词棉花；线粒体RNA提取；方法
中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2014）29-10097-02
作者简介巩养仓（1981- ），男，河南淮阳人，助理研究员，硕士，从事棉花遗传育种研究。
RNA作为遗传和表达的媒介，是目前分子生物学实验中重要的研究对象。线粒体是动植物及人类细胞重要的细胞器，具有半自主性，含有少量的DNA遗传物质，且有一套相对独立的转录翻译系统，合成自身所需要的特异蛋白。研究发现，线粒体基因组与植物细胞质雄性不育密切相关[1-4]，并推测线粒体基因组重组或重排以及RNA编辑现象可能是导致植物细胞质雄性不育的重要原因[5-8]。因此，对线粒体基因组的研究成为细胞质雄性不育研究的热点。提取高质量的线粒体DNA及RNA是进行这些研究的第一步，也是关键的一步。关于线粒体RNA的提取，在玉米[9]、 马铃薯[10]、油菜[11]等作物上已经相当成熟，而在棉花上，虽有关于棉花线粒体DNA提取方法的介绍[12-13]，但关于棉花线粒体RNA提取方法尚未见报道。为此，笔者对此进行了初步探讨。
1材料与方法
1.1材料哈克尼西棉（Gossypium harknessii）细胞质雄性不育系种子（由中国农科院棉花研究所杂种优势利用课题组提供）。
1.2方法
1.2.1材料准备。将哈克尼西棉细胞质雄性不育系种子经温水浸泡4 h，种植于无菌沙中，30 ℃暗培养7 d左右，培养成黄化苗备用。
1.2.2试剂准备。缓冲液A： 0.05 mol/L TrisCl，0.5 mol/L Sucrose，0.005 mol/L EDTA·Na2，0.1%BSA，1%～2% PVP，0.005 mol/L巯基乙醇，pH 7.5；缓冲液B： 0.05 mol/L TrisCl，0.3 mol/L Sucrose，0.01 mol/L氯化镁，1% PVP，pH 7.5；缓冲液C： 0.05 mol/L TrisCl，0.3 mol/L Sucrose，0.01 mol/L氯化镁；缓冲液D： 0.01 mol/L TrisCl，0.6 mol/L Sucrose，0.002 mol/L EDTA·Na2，pH 7.5；RNA抽提液：2%CTAB，2%PVP，0.1 mol/L TrisHCl（pH 8.0），0.025 mol/L EDTA·Na2 （pH8.0），2.0 mol/L NaCl。混匀，加0.1%DEPC处理过夜，灭菌，用前加入终体积为2%的巯基乙醇。
氯仿∶异戊醇（24∶1，V/V）；DEPC处理水；10 mol/L LiCl，加0.1%的DEPC处理过夜，灭菌，室温保存；100%乙醇；70%乙醇用DEPC水配制，-20 ℃保存；3 mol/L醋酸钠（pH 5.2），加0.1%的DEPC处理过夜，灭菌。
1.2.3线粒体制备。线粒体制备主要是将线粒体从细胞中分离出来并保证其完整性。由于低温能够减缓线粒体氧化，为保证线粒体在提取过程中的稳定状态，整个操作都在冰上完成，并在无菌通风橱内进行。步骤如下：① 收集黄化苗，弃根，用灭菌水洗涤2次，置于研钵中；② 加入约4倍体积的缓冲液A，将组织研磨成糊状；③ 通过8层纱布过滤入50 ml离心管中，离心（2 400 r/min，4 ℃，10 min），以除去大的细胞碎片；④ 取上清，2 500 r/min冷冻离心10 min，以除去质体；⑤ 将上清液转入新的离心管中，8 000 r/min离心35 min，弃上清；⑥ 沉淀用缓冲液B悬浮后，8 000 r/min离心20 min，弃上清；⑦ 沉淀用20 ml缓冲液C悬浮，再用长针头注射器向管底缓缓注入20 ml缓冲液D，形成一个step梯度，冰浴30 min，然后8 000 r/min离心20 min，弃上清液；⑧ 沉淀再用20 ml缓冲液D悬浮，8 000 r/min离心20 min，重复2～3次，得到的沉淀即为线粒体。
1.2.4mtRNA提取。mtRNA的提取主要参照MA等[14]提取棉花总RNA的改良CTAB法，略有改动，具体步骤如下：①向沉淀中加入适量体积的提取液，65 ℃水浴10 min，剧烈振荡；②加入等体积氯仿/异戊醇（24∶1，V/V）抽提，剧烈振荡，10 000 r/min，4 ℃离心10 min，重复1～2次；③取上清，加入1/4体积的10 mol/L LiCl，混匀，4 ℃过夜沉淀；④10 000 r/min，4 ℃离心10 min，沉淀溶于DEPC处理水中；⑤加入等体积酚/氯仿抽提1次； ⑥取上清，加入1/10体积醋酸钠，2.5倍体积的无水乙醇，-70 ℃沉淀至少30 min；⑦离心（12 000 r/min，4 ℃，15 min），70%乙醇洗涤沉淀，在超净工作台上风干mtRNA，用10 μl DEPC处理水溶解，储存于-70 ℃冰箱。
1.2.5mtDNA检测。采用琼脂糖凝胶电泳检测。使用1.2%琼脂糖凝胶，取2 μl mtRNA样品在小型电泳槽中进行电泳，电压70 V，电泳时长30 min，用0.01%溴化乙锭（EtBr）溶液浸泡20 min，然后置于紫外灯下观察并拍照保存。
2结果与分析
由图1可知，没有降解的mtRNA 能够看见2条清晰的核糖体RNA带（26S 和18S），且26S的亮度约是18S 的2倍。由此可知，该方法所提取的mtRNA基本达到此标准，质量可以满足进一步的分子生物学试验。 3讨论
获得高质量的核酸是进行分子生物学相关研究的关键环节，对下一步试验的进行和结果都有很大的影响。RNA质量好坏主要体现在两点：一是完好性，所提取的核酸能否体现在动植物体内的自然长度，是否发生了降解；二是纯度，即是否有其他非核酸物质及DNA的污染，而对mtRNA而言，又要去除基因组RNA的污染。所以mtRNA的抽提，一方面要利用合适的方法去除杂质，另一方面要提供合适的环境，避免对核酸的损伤。
该试验首先从细胞中分离出完整的线粒体，然后再提取RNA。该方法避免了基因组DNA和RNA的污染，但如何分离出完整的线粒体是试验成败的关键。线粒体是细胞中最为活跃的细胞器之一，极易发生氧化破裂，该研究参考国内外相关文献并经过多次试验，成功分离出棉花完整的线粒体。
针对RNA的抽提，前人已经做了大量的研究[15-17]。相对于其他植物而言，棉花RNA抽提具有其特殊性，棉花各组织特别是花药、胚珠、纤维细胞内常含有丰富的多糖、脂类以及酚类等次生物质，如果这些物质不能有效地去除，会严重影响核酸的纯度，进而影响后续试验的进行，所以棉花RNA的抽提比其他植物更困难。该试验采用提取棉花总RNA较为成熟的改良CTAB法提取线粒体中的RNA，获得了质量较高的mtRNA。但该方法由于操作较繁琐，造成mtRNA的严重流失，该试验中，应用约20 g新鲜材料最后只得到了约0.5 μg的mtRNA，虽然质量能够满足一般试验的要求，但数量不足，很难完成对RNA数量要求较多的分子试验，如Northern杂交。所以如何提取出高质量高产出比的mtRNA，还需要进一步地探讨。
参考文献
[1] AKAGI H，SAKAMOTO M，SHINJYO C，et al.A unique sequence located downstream from the rice mitochondrial atp6 may cause male sterility[J].Curr Genet，1994，25：52-58.
[2] ASHUTOSH，KUMAR P，DINESH，K V，et al.A novel orf108 cotranscribed with the atpA gene is associated with cytoplasmic male sterility in Brassica juncea carrying Moricandia arvensis cytoplasm[J].Plant Cell Physiol，2008，49（2）：284-289.
[3] 李小明，郑用琏，张方东，等.红莲型细胞质雄性不育水稻线粒体DNA的RFLP分析[J].遗传，2000，22（4）：201-204.
[4] HUANG W，WANG L，YI P，et al.RFLP analysis for mitochondrial genome of CMS-rice[J].Acta Genetica Sinica，2006，33（4）：330-338.
[5] ARAYA ALEXANDRE，ZABALETA EDUARDO，BLANC VALERIE，et al.RNA editing in plant mitochondria，cytoplasmic male sterility and plant breeding[J].Plant Biotechnology，1998，1（1）：31-39.
[6] HEAZLEWOOD J L，WHELAN J，MILLAR A H.The products of the mitochondrial orf25 and orfB genes are F0 components in the plant F1F0 ATP synthase[J].FEBS，2003，540：201-205.
[7] 巩养仓，邢朝柱.植物细胞质雄性不育分子机理研究进展[J].分子植物育种，2006，4（S2）：51-56.
[8] HOWAD W，TANG H V，PRING D R，et al.Nuclear genes from T×CMS maintainer lines are unable to maintain atp6 RNA editing in any anther cell-type in the sorghum bicolor A3 cytoplasm[J].Curr Genet，1999，36：62-68.
[9] GALLAGHER L J，BETZ S K，CHASE C D.Mitochondrial RNA editing truncates a chimeric open reading frame associated with S male-sterility in maize[J].Curr Genet，2002，42：179-184.
[10] NUNZIA S，TEODORO C，LAURENCE M.Mitochondrial DNA and RNA Isolation from Potato Tissue[J].Plant Molecular Biology Reporter，2001，19（3）：67.
[11] 陈德富，陈喜文，邹卫国，等.一种有效的花粉线粒体RNA分离技术[J].植物生理学通讯，1999，35（3）：211-214.
[12] 刘少林，靖深蓉，严根土，等.棉花线粒体和线粒体DNA的分离与纯化[J].棉花学报，1996，8（6）：316-317.
[13] 胡建斌，黄晋玲，郭三堆.一种棉花线粒体DNA的提取方法[J].生物技术通报，2005（6）：88-90.
[14] MA X D，XING C Z，GUO L ，et al.Analysis of differentially expressed genes in genic male sterility cotton （Gossypium hirsutum L.） using cDNA-AFLP[J].Journal of Genetics and Genomics，2007，34（6）：536-543.
[15] 蒋建雄，张天真.利用CTAB/酸酚法提取棉花组织总RNA[J].棉花学报，2003，15（3）：166-167.
[16] 温小杰，张桂寅，王省芬，等.棉花组织总RNA的快速提取方法[J].分子植物育种，2004，2（1）：147-150.
[17] 史公军，侯喜林，王彦华.植物组织RNA的几种提取方法[J].西南农业学报，2005，18（2）：225-227.安徽农业科学，Journal of Anhui Agri. Sci.2014，42（29）：10099-10101
关键词棉花；线粒体RNA提取；方法
中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2014）29-10097-02
作者简介巩养仓（1981- ），男，河南淮阳人，助理研究员，硕士，从事棉花遗传育种研究。
RNA作为遗传和表达的媒介，是目前分子生物学实验中重要的研究对象。线粒体是动植物及人类细胞重要的细胞器，具有半自主性，含有少量的DNA遗传物质，且有一套相对独立的转录翻译系统，合成自身所需要的特异蛋白。研究发现，线粒体基因组与植物细胞质雄性不育密切相关[1-4]，并推测线粒体基因组重组或重排以及RNA编辑现象可能是导致植物细胞质雄性不育的重要原因[5-8]。因此，对线粒体基因组的研究成为细胞质雄性不育研究的热点。提取高质量的线粒体DNA及RNA是进行这些研究的第一步，也是关键的一步。关于线粒体RNA的提取，在玉米[9]、 马铃薯[10]、油菜[11]等作物上已经相当成熟，而在棉花上，虽有关于棉花线粒体DNA提取方法的介绍[12-13]，但关于棉花线粒体RNA提取方法尚未见报道。为此，笔者对此进行了初步探讨。
1材料与方法
1.1材料哈克尼西棉（Gossypium harknessii）细胞质雄性不育系种子（由中国农科院棉花研究所杂种优势利用课题组提供）。
1.2方法
1.2.1材料准备。将哈克尼西棉细胞质雄性不育系种子经温水浸泡4 h，种植于无菌沙中，30 ℃暗培养7 d左右，培养成黄化苗备用。
1.2.2试剂准备。缓冲液A： 0.05 mol/L TrisCl，0.5 mol/L Sucrose，0.005 mol/L EDTA·Na2，0.1%BSA，1%～2% PVP，0.005 mol/L巯基乙醇，pH 7.5；缓冲液B： 0.05 mol/L TrisCl，0.3 mol/L Sucrose，0.01 mol/L氯化镁，1% PVP，pH 7.5；缓冲液C： 0.05 mol/L TrisCl，0.3 mol/L Sucrose，0.01 mol/L氯化镁；缓冲液D： 0.01 mol/L TrisCl，0.6 mol/L Sucrose，0.002 mol/L EDTA·Na2，pH 7.5；RNA抽提液：2%CTAB，2%PVP，0.1 mol/L TrisHCl（pH 8.0），0.025 mol/L EDTA·Na2 （pH8.0），2.0 mol/L NaCl。混匀，加0.1%DEPC处理过夜，灭菌，用前加入终体积为2%的巯基乙醇。
氯仿∶异戊醇（24∶1，V/V）；DEPC处理水；10 mol/L LiCl，加0.1%的DEPC处理过夜，灭菌，室温保存；100%乙醇；70%乙醇用DEPC水配制，-20 ℃保存；3 mol/L醋酸钠（pH 5.2），加0.1%的DEPC处理过夜，灭菌。
1.2.3线粒体制备。线粒体制备主要是将线粒体从细胞中分离出来并保证其完整性。由于低温能够减缓线粒体氧化，为保证线粒体在提取过程中的稳定状态，整个操作都在冰上完成，并在无菌通风橱内进行。步骤如下：① 收集黄化苗，弃根，用灭菌水洗涤2次，置于研钵中；② 加入约4倍体积的缓冲液A，将组织研磨成糊状；③ 通过8层纱布过滤入50 ml离心管中，离心（2 400 r/min，4 ℃，10 min），以除去大的细胞碎片；④ 取上清，2 500 r/min冷冻离心10 min，以除去质体；⑤ 将上清液转入新的离心管中，8 000 r/min离心35 min，弃上清；⑥ 沉淀用缓冲液B悬浮后，8 000 r/min离心20 min，弃上清；⑦ 沉淀用20 ml缓冲液C悬浮，再用长针头注射器向管底缓缓注入20 ml缓冲液D，形成一个step梯度，冰浴30 min，然后8 000 r/min离心20 min，弃上清液；⑧ 沉淀再用20 ml缓冲液D悬浮，8 000 r/min离心20 min，重复2～3次，得到的沉淀即为线粒体。
1.2.4mtRNA提取。mtRNA的提取主要参照MA等[14]提取棉花总RNA的改良CTAB法，略有改动，具体步骤如下：①向沉淀中加入适量体积的提取液，65 ℃水浴10 min，剧烈振荡；②加入等体积氯仿/异戊醇（24∶1，V/V）抽提，剧烈振荡，10 000 r/min，4 ℃离心10 min，重复1～2次；③取上清，加入1/4体积的10 mol/L LiCl，混匀，4 ℃过夜沉淀；④10 000 r/min，4 ℃离心10 min，沉淀溶于DEPC处理水中；⑤加入等体积酚/氯仿抽提1次； ⑥取上清，加入1/10体积醋酸钠，2.5倍体积的无水乙醇，-70 ℃沉淀至少30 min；⑦离心（12 000 r/min，4 ℃，15 min），70%乙醇洗涤沉淀，在超净工作台上风干mtRNA，用10 μl DEPC处理水溶解，储存于-70 ℃冰箱。
1.2.5mtDNA检测。采用琼脂糖凝胶电泳检测。使用1.2%琼脂糖凝胶，取2 μl mtRNA样品在小型电泳槽中进行电泳，电压70 V，电泳时长30 min，用0.01%溴化乙锭（EtBr）溶液浸泡20 min，然后置于紫外灯下观察并拍照保存。
2结果与分析
由图1可知，没有降解的mtRNA 能够看见2条清晰的核糖体RNA带（26S 和18S），且26S的亮度约是18S 的2倍。由此可知，该方法所提取的mtRNA基本达到此标准，质量可以满足进一步的分子生物学试验。 3讨论
获得高质量的核酸是进行分子生物学相关研究的关键环节，对下一步试验的进行和结果都有很大的影响。RNA质量好坏主要体现在两点：一是完好性，所提取的核酸能否体现在动植物体内的自然长度，是否发生了降解；二是纯度，即是否有其他非核酸物质及DNA的污染，而对mtRNA而言，又要去除基因组RNA的污染。所以mtRNA的抽提，一方面要利用合适的方法去除杂质，另一方面要提供合适的环境，避免对核酸的损伤。
该试验首先从细胞中分离出完整的线粒体，然后再提取RNA。该方法避免了基因组DNA和RNA的污染，但如何分离出完整的线粒体是试验成败的关键。线粒体是细胞中最为活跃的细胞器之一，极易发生氧化破裂，该研究参考国内外相关文献并经过多次试验，成功分离出棉花完整的线粒体。
针对RNA的抽提，前人已经做了大量的研究[15-17]。相对于其他植物而言，棉花RNA抽提具有其特殊性，棉花各组织特别是花药、胚珠、纤维细胞内常含有丰富的多糖、脂类以及酚类等次生物质，如果这些物质不能有效地去除，会严重影响核酸的纯度，进而影响后续试验的进行，所以棉花RNA的抽提比其他植物更困难。该试验采用提取棉花总RNA较为成熟的改良CTAB法提取线粒体中的RNA，获得了质量较高的mtRNA。但该方法由于操作较繁琐，造成mtRNA的严重流失，该试验中，应用约20 g新鲜材料最后只得到了约0.5 μg的mtRNA，虽然质量能够满足一般试验的要求，但数量不足，很难完成对RNA数量要求较多的分子试验，如Northern杂交。所以如何提取出高质量高产出比的mtRNA，还需要进一步地探讨。
参考文献
[1] AKAGI H，SAKAMOTO M，SHINJYO C，et al.A unique sequence located downstream from the rice mitochondrial atp6 may cause male sterility[J].Curr Genet，1994，25：52-58.
[2] ASHUTOSH，KUMAR P，DINESH，K V，et al.A novel orf108 cotranscribed with the atpA gene is associated with cytoplasmic male sterility in Brassica juncea carrying Moricandia arvensis cytoplasm[J].Plant Cell Physiol，2008，49（2）：284-289.
[3] 李小明，郑用琏，张方东，等.红莲型细胞质雄性不育水稻线粒体DNA的RFLP分析[J].遗传，2000，22（4）：201-204.
[4] HUANG W，WANG L，YI P，et al.RFLP analysis for mitochondrial genome of CMS-rice[J].Acta Genetica Sinica，2006，33（4）：330-338.
[5] ARAYA ALEXANDRE，ZABALETA EDUARDO，BLANC VALERIE，et al.RNA editing in plant mitochondria，cytoplasmic male sterility and plant breeding[J].Plant Biotechnology，1998，1（1）：31-39.
[6] HEAZLEWOOD J L，WHELAN J，MILLAR A H.The products of the mitochondrial orf25 and orfB genes are F0 components in the plant F1F0 ATP synthase[J].FEBS，2003，540：201-205.
[7] 巩养仓，邢朝柱.植物细胞质雄性不育分子机理研究进展[J].分子植物育种，2006，4（S2）：51-56.
[8] HOWAD W，TANG H V，PRING D R，et al.Nuclear genes from T×CMS maintainer lines are unable to maintain atp6 RNA editing in any anther cell-type in the sorghum bicolor A3 cytoplasm[J].Curr Genet，1999，36：62-68.
[9] GALLAGHER L J，BETZ S K，CHASE C D.Mitochondrial RNA editing truncates a chimeric open reading frame associated with S male-sterility in maize[J].Curr Genet，2002，42：179-184.
[10] NUNZIA S，TEODORO C，LAURENCE M.Mitochondrial DNA and RNA Isolation from Potato Tissue[J].Plant Molecular Biology Reporter，2001，19（3）：67.
[11] 陈德富，陈喜文，邹卫国，等.一种有效的花粉线粒体RNA分离技术[J].植物生理学通讯，1999，35（3）：211-214.
[12] 刘少林，靖深蓉，严根土，等.棉花线粒体和线粒体DNA的分离与纯化[J].棉花学报，1996，8（6）：316-317.
[13] 胡建斌，黄晋玲，郭三堆.一种棉花线粒体DNA的提取方法[J].生物技术通报，2005（6）：88-90.
[14] MA X D，XING C Z，GUO L ，et al.Analysis of differentially expressed genes in genic male sterility cotton （Gossypium hirsutum L.） using cDNA-AFLP[J].Journal of Genetics and Genomics，2007，34（6）：536-543.
[15] 蒋建雄，张天真.利用CTAB/酸酚法提取棉花组织总RNA[J].棉花学报，2003，15（3）：166-167.
[16] 温小杰，张桂寅，王省芬，等.棉花组织总RNA的快速提取方法[J].分子植物育种，2004，2（1）：147-150.
[17] 史公军，侯喜林，王彦华.植物组织RNA的几种提取方法[J].西南农业学报，2005，18（2）：225-227.安徽农业科学，Journal of Anhui Agri. Sci.2014，42（29）：10099-10101