【摘 要】
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目的 探究肌萎缩侧索硬化症和额颞叶痴呆疾病相关9号染色体开放阅读框72基因(C9orf72)内六核苷酸GGGGCC重复序列非常规翻译产物二肽重复蛋白聚-脯氨酸-精氨酸(poly-PR)、聚-甘氨酸-丙氨酸(poly-GA)和聚-甘氨酸-精氨酸(poly-GR)对线粒体生物学功能的影响.方法 首先将重复4次的人细胞色素c氧化酶亚基Ⅷ线粒体定位序列(4mt)分别插入到含二肽重复50次的pEGFP-C1-PR50,-GR50和-GA50质粒上,将该重组质粒经测序和双酶切鉴定后转染293T细胞,通过Western
【机 构】
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国家生物医学分析中心,北京 100850
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目的 探究肌萎缩侧索硬化症和额颞叶痴呆疾病相关9号染色体开放阅读框72基因(C9orf72)内六核苷酸GGGGCC重复序列非常规翻译产物二肽重复蛋白聚-脯氨酸-精氨酸(poly-PR)、聚-甘氨酸-丙氨酸(poly-GA)和聚-甘氨酸-精氨酸(poly-GR)对线粒体生物学功能的影响.方法 首先将重复4次的人细胞色素c氧化酶亚基Ⅷ线粒体定位序列(4mt)分别插入到含二肽重复50次的pEGFP-C1-PR50,-GR50和-GA50质粒上,将该重组质粒经测序和双酶切鉴定后转染293T细胞,通过Western印迹法检测293T细胞二肽重复蛋白PR50,GR50和GA50表达水平.随后将上述重组质粒用Lipofectamine 2000分别转染HeLa细胞,通过四甲罗丹明甲酯(TMRM)和线粒体超氧化物红色荧光探针(MitoSOX)染色,用宽场荧光显微成像检测二肽重复蛋白PR50,GA50和GR50对HeLa细胞线粒体形态、数目、膜电位和氧化应激水平的影响.通过慢病毒感染HeLa细胞和嘌呤霉素筛选获得稳定表达PR50,GA50和GR50的细胞系,用ATP检测试剂盒检测PR50,GR50和GA50对细胞内ATP水平的影响.结果 成功构建带有线粒体定位序列的4mt-EGFP-C1及4mt-EGFP-C1-PR50,-GR50和-GA50重组质粒.Western印迹法鉴定结果显示,二肽重复蛋白PR50,GA50和GR50在293T细胞中表达正确.线粒体功能评价实验结果表明,与4mt-EGFP-C1对照组相比,PR50和GR50过表达可使HeLa细胞线粒体形态改变,线粒体数目显著增加(P<0.05),线粒体膜电位降低(P<0.05,P<0.01),氧化应激反应增强(P<0.05,P<0.01),ATP水平下降(P<0.05);而GA50过表达则对线粒体功能无影响.结论 富含精氨酸的二肽重复蛋白PR50和GR50进入线粒体,可损伤线粒体生物学功能.
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