【摘 要】
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目的 系统构建雄激素受体（AR）野生型全长和4个功能域截短体的原核表达质粒,Western blot与凝胶迁移（EMSA）实验鉴定各融合蛋白及其功能。方法 基于pGEX-4T-1载体,构建AR全长及各功能域的谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合表达重组质粒。应用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）对重组质粒进行诱导表达,确定各重组蛋白的最佳参数。分别用AR内源性抗体和GST标签抗体进行Wester
【基金项目】
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国家自然科学基金（编号:81873966）； 福建医科大学高层次人才启动经费计划（编号:XRCZX2019016）； 病毒学国家重点实验室开放研究基金（编号:2020KF007）； 福建省自然科学基金项目（编号:2021J01663）；
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目的 系统构建雄激素受体（AR）野生型全长和4个功能域截短体的原核表达质粒,Western blot与凝胶迁移（EMSA）实验鉴定各融合蛋白及其功能。方法 基于pGEX-4T-1载体,构建AR全长及各功能域的谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合表达重组质粒。应用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）对重组质粒进行诱导表达,确定各重组蛋白的最佳参数。分别用AR内源性抗体和GST标签抗体进行Western blot鉴定,分析诱导前、诱导后细菌裂解液中的目的蛋白,并利用谷胱甘肽琼脂糖树脂进一步纯化。将纯化后蛋白与病毒荧光探针进行孵育,复合物于非变性凝胶中电泳检测纯化蛋白功能。结果 成功构建了AR全长和3个功能域截短体的原核表达质粒。PCR和双酶切鉴定均显示在各插入片段大小相符处出现阳性条带,且测序结果与NCBI GenBank标准株比对一致。其中,96 ku GST-AR-NTD+DBD与86 ku GST-AR-NTD两个融合蛋白得以成功表达及后续纯化。纯化蛋白可与病毒基因组DNA直接结合。结论 来源同一基因序列的AR截短体重组质粒原核表达条件不同,纯化后的AR蛋白可用于深入了解AR各功能域与其他分子间的直接相互作用机制。
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