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摘要：目的：探讨鱼角膜作为板层角膜移植的可行性。方法：在无菌操作下，摘除鲜活鱼眼球，常规钻、切所需植片，脱细胞、交联后制成生物角膜。从拉伸强度，透光率和相容性几个方面对鱼角膜分析，并将鱼角膜植入家兔眼中，术后观察6个月。结果：平均拉伸强度为3.94N，有较好的抗手术缝合性能。透光率为82%。人源角膜上皮细胞附着在生物角膜上，生长良好。植入家兔眼中观察6个月无明显炎症和排斥反应。
关键词：鱼；板层角膜；移植
Methods：under the aseptic operation，the fresh live fish eyeballs were removed，and grafts needed for conventional drilling，then the cornea the cornea was made after decellularization and cross-linked. The fish cornea was analyzed from tensile strength，transmittance and compatibility，and was implanted into the eyes of rabbits for 6 months after operation.
Results：the average tensile strength was 3.94N，which had better anti surgical suture performance. The transmittance rate is 82%. Human corneal epithelial cells attach to biological corneas and grow well. No obvious inflammation and rejection occurred in the eyes of rabbits implanted for 6 months.
板层角膜移植是一种部分厚度的角膜移植，手术时仅切除角膜前面的病变组织，再移植以部分厚度的透明角膜供体，修补切除区域，在我国是治疗角膜病的主要手术方法之一（1）。这种手术方法对眼内组织损伤小，术后排斥率低等优点。但国内角膜供体缺乏成为制约角膜移植手术开展的主要因素（2），国内已经有关于脱细胞猪角膜脱细胞基质的产品上市，但对于有不同宗教信仰等民众来说，脱细胞猪角膜在伦理上难以接受。鱼类角膜量大、繁殖快、种类多、成本低的优点，且无关宗教信仰。因此，选择鱼类角膜作为角膜移植使其成为一种可能，2000年，有报道称深圳武警医院将鱼角膜植入人体取得一定效果。之后却少有研究报道，我们使用处理后的鱼眼作为生物角膜植入家兔角膜中，对该类材料的适用性进行探讨。
1仪器与试剂
1.1 仪器设备：光学显微镜（上海普赫）、荧光显微镜（广州明美）、细胞培养箱（Thermo公司）、紫外可见分光光度计（Perkin Elmer），美斯特朗材料试验机INSTRON（美国英斯特朗）。常规角膜手术器械、环钻、切割台、培养皿、移液枪、枪头、细胞计数板、10ml、5ml注射器。
1.2 试剂：庆大霉素，生理盐水、高糖培养基、胰酶、双抗、人源上皮细胞、戊二醛、DAPI、速眠新、盐酸丙卡美因、苏醒宁、戊巴比妥钠、PBS、荧光素钠、EDC/NHS、MES、典必殊滴眼液。
2 實验对象
金枪鱼 摘除新鲜鱼眼球，用生理盐水冲洗3次，置于1：100庆大霉素中浸泡10min，用棉签刮去上皮（图1），脱细胞处理（图2为脱细胞后镜下HE染色照片），常规角膜切割后交联处理，清洗，制备成生物角膜待用。脱细胞方法：在37℃温度下，质量分数0.25%胰酶中震摇1h，PBS（phosphate puffer sodium）漂洗3次，在-80℃条件下冷冻3d（3）。交联方法：将角膜浸入含50mM EDC（1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）的溶液中，NHS按nEDC：nNHS=4：1的量加入，以MES为缓冲剂调pH 值至5.5，4℃下放置48 h，再用0.1mol /L的Na2HPO4 溶液浸泡1h，最后经去离子水清洗12h。
3 实验方法
3.1.1透明植片外观
3.1.2 HE染色图片
3.2 生物角膜拉伸强度
用两根5-0的缝线分别扎生物角膜两端边缘处，将两根缝线分别固定在力学试验机两端夹具上，用40mm/min的速度向两端拉伸，至角膜撕裂，记录缝线撕裂时的最大拉力，即为缝合力。
缝合强度测试结果见下表。
生物角膜的平均缝合强度可达到3.94N，可抵抗手术线缝合。
3.3 透光率
将鱼角膜固定于紫外可见分光光度计的样品仓中，在380～800nm波长范围内，每隔10nm波长取一个检测点，连续检测样本的透过率。角膜的透过率结果详见下图。
可见角膜的平均透过率为82%。
3.3生物相容性
3.3.1 细胞粘附实验，细胞贴壁率
①实验材料：生物角膜
②将材料裁成面积为0.5×0.5cm2；
③收集培养3-4d的人源角膜上皮细胞，接种于96孔板中的角膜材料上；
④接种时间分2个时间点为：6h，8h；
⑤将最终培养好的生物角膜加1mL PBS洗涤一次，取出用戊二醛固定；
⑥培养孔里细胞残留量做绝对计数（N1）算出有效贴附率即：（N0-N1）/N0×100%；
⑦细胞浓度为：N0 =20×105个/ml
从以上表中数据看出，生物角膜材料与人源角膜上皮细胞有良好的相容性。 3.3.2 DAPI染色观察
①实验材料：生物角膜；
②将材料裁成面积为0.5×0.5cm2；
③收集培养3-4d的人源角膜上皮细胞，接种于96孔板中的角膜材料上；
④细胞浓度为：C =5×10 4个 /孔；
⑤细胞培养时间点为：48小时，72h；
⑥将最终培养好的细胞加1mL PBS洗涤2-3次，用2.5%戊二醛固定30min后，PBS洗涤2-3次；加100ng/mL DAPI染料，染色20-30min，PBS洗涤2-3次，荧光显微镜下观察，结果见下图。
荧光显微镜观察核形比较完整，染色质也比较均匀。
光学显微镜下观察，人源上皮细胞附着于生物角膜材料上，呈梭形生长。
3.4 动物实验
为了更有效评估鱼眼作为生物角膜可行性，实验进行新西兰大白兔的板层角膜移植。右眼为空白对照眼，左眼为手术眼。常规全麻下，在无菌操作下用环钻联合手术刀剖切法在角膜中央制作直径为7.5mm的板层植床。将处理后生物角膜使用环钻钻取直径为7.75mm的角膜植片，以10-0尼龙线间断缝合针，将植片固定于植床上。术后给予典必殊滴眼液滴眼，维持一周。
临床观察，重4500g左右鱼的角膜直径与人角膜接近，中央厚1000μm，边缘1500μm，刮去上皮，均取中央部分的角膜。正常人角膜中央厚度为464μm～757μm，旁中心厚度为486μm～793μm，周边厚度为533μm～923μm（4）。国外早在1979年Hag（5）首先用海鱼（rock cocl）在阿拉伯联合酋长国居民中用海鱼角膜移植治疗重症沙眼引起的角膜溃疡及天花引起角膜混浊获得成功，为国际眼科用异种异体角膜移植手术奠定了医学基础。
（a）手术后，植片透明性良好；（b）术后7天，植片完全上皮化，透明性良，无明显炎症；（c）术后半个月，植片透明性稍微变差，正中间有些许水肿，上皮已经完全生长；（d）术后1个月，拆除缝合线，植片中间轻微发白，无明显炎症，无血管长入；（e）术后3个月透明性良好，无明显炎症，无排斥反应，无血管长入；（f）术后半年透明性非常好。
4结论
鱼为低等动物，鱼眼角膜具有哺乳类动物角膜所具有的各层组织。鱼类和禽类角膜移植后成功率较高（6）。处理后的鱼眼作为生物角膜植入兔角膜中，无明显炎症，排斥反应较轻，生物相容性好，光学、力学强度和人角膜指数相当，体外细胞培养实验表面，支持上皮细胞生长。鱼眼角膜具备哺乳动物角膜所具有的各层组织，移植后植片易透明愈合，因此，在角膜移植术中角膜很有可能替代人同种角膜。
参考文献：
[1]李京，等。角膜成分移植临床应用的研究进展，吉林大学学报（医学版）2014，40（2）：695-697.
[2]张明昌，我国角膜移植材料的匮乏问题及解决对策，中华眼科杂志2007；43（4）：289-292.
[3]刘晓霞，陈建苏，徐锦堂，不同方法处理的角膜脱细胞基质组织学生物特性的比较，暨南大学学报（医学版）2007；28（2）：164-167.
[4]王丽娅，我国成人正常眼与近视眼的多方位角膜厚度测量，眼科1995；4（2）；81.
[5]Hag M，Opnfhacmdogy procedmgs of the infemonat.Congreclss Luptop Vpi 2006；8：1688-1693.
[6]馬生虎，陈建宏，等。鱼眼角膜板层移植的临床研究，宁夏医学杂志，1999，20（3）：136-137.
关键词：鱼；板层角膜；移植
Methods：under the aseptic operation，the fresh live fish eyeballs were removed，and grafts needed for conventional drilling，then the cornea the cornea was made after decellularization and cross-linked. The fish cornea was analyzed from tensile strength，transmittance and compatibility，and was implanted into the eyes of rabbits for 6 months after operation.
Results：the average tensile strength was 3.94N，which had better anti surgical suture performance. The transmittance rate is 82%. Human corneal epithelial cells attach to biological corneas and grow well. No obvious inflammation and rejection occurred in the eyes of rabbits implanted for 6 months.
板层角膜移植是一种部分厚度的角膜移植，手术时仅切除角膜前面的病变组织，再移植以部分厚度的透明角膜供体，修补切除区域，在我国是治疗角膜病的主要手术方法之一（1）。这种手术方法对眼内组织损伤小，术后排斥率低等优点。但国内角膜供体缺乏成为制约角膜移植手术开展的主要因素（2），国内已经有关于脱细胞猪角膜脱细胞基质的产品上市，但对于有不同宗教信仰等民众来说，脱细胞猪角膜在伦理上难以接受。鱼类角膜量大、繁殖快、种类多、成本低的优点，且无关宗教信仰。因此，选择鱼类角膜作为角膜移植使其成为一种可能，2000年，有报道称深圳武警医院将鱼角膜植入人体取得一定效果。之后却少有研究报道，我们使用处理后的鱼眼作为生物角膜植入家兔角膜中，对该类材料的适用性进行探讨。
1仪器与试剂
1.1 仪器设备：光学显微镜（上海普赫）、荧光显微镜（广州明美）、细胞培养箱（Thermo公司）、紫外可见分光光度计（Perkin Elmer），美斯特朗材料试验机INSTRON（美国英斯特朗）。常规角膜手术器械、环钻、切割台、培养皿、移液枪、枪头、细胞计数板、10ml、5ml注射器。
1.2 试剂：庆大霉素，生理盐水、高糖培养基、胰酶、双抗、人源上皮细胞、戊二醛、DAPI、速眠新、盐酸丙卡美因、苏醒宁、戊巴比妥钠、PBS、荧光素钠、EDC/NHS、MES、典必殊滴眼液。
2 實验对象
金枪鱼 摘除新鲜鱼眼球，用生理盐水冲洗3次，置于1：100庆大霉素中浸泡10min，用棉签刮去上皮（图1），脱细胞处理（图2为脱细胞后镜下HE染色照片），常规角膜切割后交联处理，清洗，制备成生物角膜待用。脱细胞方法：在37℃温度下，质量分数0.25%胰酶中震摇1h，PBS（phosphate puffer sodium）漂洗3次，在-80℃条件下冷冻3d（3）。交联方法：将角膜浸入含50mM EDC（1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）的溶液中，NHS按nEDC：nNHS=4：1的量加入，以MES为缓冲剂调pH 值至5.5，4℃下放置48 h，再用0.1mol /L的Na2HPO4 溶液浸泡1h，最后经去离子水清洗12h。
3 实验方法
3.1.1透明植片外观
3.1.2 HE染色图片
3.2 生物角膜拉伸强度
用两根5-0的缝线分别扎生物角膜两端边缘处，将两根缝线分别固定在力学试验机两端夹具上，用40mm/min的速度向两端拉伸，至角膜撕裂，记录缝线撕裂时的最大拉力，即为缝合力。
缝合强度测试结果见下表。
生物角膜的平均缝合强度可达到3.94N，可抵抗手术线缝合。
3.3 透光率
将鱼角膜固定于紫外可见分光光度计的样品仓中，在380～800nm波长范围内，每隔10nm波长取一个检测点，连续检测样本的透过率。角膜的透过率结果详见下图。
可见角膜的平均透过率为82%。
3.3生物相容性
3.3.1 细胞粘附实验，细胞贴壁率
①实验材料：生物角膜
②将材料裁成面积为0.5×0.5cm2；
③收集培养3-4d的人源角膜上皮细胞，接种于96孔板中的角膜材料上；
④接种时间分2个时间点为：6h，8h；
⑤将最终培养好的生物角膜加1mL PBS洗涤一次，取出用戊二醛固定；
⑥培养孔里细胞残留量做绝对计数（N1）算出有效贴附率即：（N0-N1）/N0×100%；
⑦细胞浓度为：N0 =20×105个/ml
从以上表中数据看出，生物角膜材料与人源角膜上皮细胞有良好的相容性。 3.3.2 DAPI染色观察
①实验材料：生物角膜；
②将材料裁成面积为0.5×0.5cm2；
③收集培养3-4d的人源角膜上皮细胞，接种于96孔板中的角膜材料上；
④细胞浓度为：C =5×10 4个 /孔；
⑤细胞培养时间点为：48小时，72h；
⑥将最终培养好的细胞加1mL PBS洗涤2-3次，用2.5%戊二醛固定30min后，PBS洗涤2-3次；加100ng/mL DAPI染料，染色20-30min，PBS洗涤2-3次，荧光显微镜下观察，结果见下图。
荧光显微镜观察核形比较完整，染色质也比较均匀。
光学显微镜下观察，人源上皮细胞附着于生物角膜材料上，呈梭形生长。
3.4 动物实验
为了更有效评估鱼眼作为生物角膜可行性，实验进行新西兰大白兔的板层角膜移植。右眼为空白对照眼，左眼为手术眼。常规全麻下，在无菌操作下用环钻联合手术刀剖切法在角膜中央制作直径为7.5mm的板层植床。将处理后生物角膜使用环钻钻取直径为7.75mm的角膜植片，以10-0尼龙线间断缝合针，将植片固定于植床上。术后给予典必殊滴眼液滴眼，维持一周。
临床观察，重4500g左右鱼的角膜直径与人角膜接近，中央厚1000μm，边缘1500μm，刮去上皮，均取中央部分的角膜。正常人角膜中央厚度为464μm～757μm，旁中心厚度为486μm～793μm，周边厚度为533μm～923μm（4）。国外早在1979年Hag（5）首先用海鱼（rock cocl）在阿拉伯联合酋长国居民中用海鱼角膜移植治疗重症沙眼引起的角膜溃疡及天花引起角膜混浊获得成功，为国际眼科用异种异体角膜移植手术奠定了医学基础。
（a）手术后，植片透明性良好；（b）术后7天，植片完全上皮化，透明性良，无明显炎症；（c）术后半个月，植片透明性稍微变差，正中间有些许水肿，上皮已经完全生长；（d）术后1个月，拆除缝合线，植片中间轻微发白，无明显炎症，无血管长入；（e）术后3个月透明性良好，无明显炎症，无排斥反应，无血管长入；（f）术后半年透明性非常好。
4结论
鱼为低等动物，鱼眼角膜具有哺乳类动物角膜所具有的各层组织。鱼类和禽类角膜移植后成功率较高（6）。处理后的鱼眼作为生物角膜植入兔角膜中，无明显炎症，排斥反应较轻，生物相容性好，光学、力学强度和人角膜指数相当，体外细胞培养实验表面，支持上皮细胞生长。鱼眼角膜具备哺乳动物角膜所具有的各层组织，移植后植片易透明愈合，因此，在角膜移植术中角膜很有可能替代人同种角膜。
参考文献：
[1]李京，等。角膜成分移植临床应用的研究进展，吉林大学学报（医学版）2014，40（2）：695-697.
[2]张明昌，我国角膜移植材料的匮乏问题及解决对策，中华眼科杂志2007；43（4）：289-292.
[3]刘晓霞，陈建苏，徐锦堂，不同方法处理的角膜脱细胞基质组织学生物特性的比较，暨南大学学报（医学版）2007；28（2）：164-167.
[4]王丽娅，我国成人正常眼与近视眼的多方位角膜厚度测量，眼科1995；4（2）；81.
[5]Hag M，Opnfhacmdogy procedmgs of the infemonat.Congreclss Luptop Vpi 2006；8：1688-1693.
[6]馬生虎，陈建宏，等。鱼眼角膜板层移植的临床研究，宁夏医学杂志，1999，20（3）：136-137.