【摘 要】
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目的 构建分枝杆菌膜锚定表达载体,并分析外源目标蛋白的表达情况及其亚细胞定位.方法 在分枝杆菌胞内表达载体pMFA42的基础上进行改造,人工合成结核分枝杆菌(Mycobacterium
【机 构】
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苏州大学医学部基础医学与生命科学学院,复旦大学附属上海市公共卫生临床中心
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目的 构建分枝杆菌膜锚定表达载体,并分析外源目标蛋白的表达情况及其亚细胞定位.方法 在分枝杆菌胞内表达载体pMFA42的基础上进行改造,人工合成结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)相对分子质量(Mr)为19×103的脂蛋白膜分泌信号序列,将其插入高效的突变型 furA基因启动子(pfurAma)下游构建新型的分枝杆菌膜锚定表达载体pMFA42M.PCR扩增增强型绿色荧光蛋白(EGFP)编码基因,亚克隆至上述两种载体中并电转化耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,Ms),分别获得重组EGFP融合表达菌株和膜锚定表达菌株;接着将Mtb主要保护性抗原Ag85A及其嵌合抗原Ag856A2的编码基因亚克隆入膜锚定表达载体pMFA42M中构建Mtb抗原-EGFP融合表达菌株;通过Western blot和流式细胞表面标记技术来分析目标抗原的表达水平及其亚细胞定位,并进一步通过荧光显微镜直接观察重组EGFP融合表达菌株在体外和感染巨噬细胞后的荧光强度.结果 通过引入Mtb 19×103脂蛋白膜分泌信号,在高效pfurAma启动子的驱动下,成功地构建了分枝杆菌膜锚定表达载体.利用EGFP作为标签抗原,通过Western blot、荧光显微观察和流式细胞表面标记等技术均证实了外源目标抗原可在分枝杆菌中高水平表达并定位至细胞膜上.结论 本研究为重组BCG和分枝杆菌膜蛋白功能研究提供了一种新型的膜锚定表达载体,所构建的EGFP重组表达菌株亦可作为一种模式示踪菌为细胞吞噬和动物免疫中的细菌定植和移位分析提供新思路.
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