论文部分内容阅读
目的:关节软骨创伤难以自行修复,传统疗法因修复的组织以纤维软骨为主,缺少正常透明软骨的力学性能及耐用性。种子细胞是组织工程化软骨形成的首要条件,为此拟建立一套较为简便、有效和实用的脐血间充质干细胞体外分离培养体系,探讨其向软骨细胞分化的可行性。方法:实验于2005-07/2006-09在右江民族医学院组织学与胚胎学教研室完成。①细胞来源:无妊娠并发症足月分娩后的胎盘脐静脉血,均征得供者同意,实验经医院医学伦理委员会批准。②实验方法:穿刺抽取15mL脐带血,密度梯度法分离吸取分层界面的白色环形絮状物,其中富含单个核细胞,离心后沉积细胞用含15%胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的DMEM高糖培养基悬浮,调整细胞密度为1×109L-1接种于25T培养瓶内,放置在37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中培养,72h后更换培养基,去除红细胞及其他未贴壁细胞,至70%~80%融合时传代。③实验评估:取传至第2代的脐带血间充质干细胞进行增殖能力检测;加入含终浓度为100μg/L胰岛素样生长因子1,15%胎牛血清的DMEM软骨细胞诱导培养基,倒置显微镜下连续观察细胞生长情况,并行苏木精-伊红染色,应用扫描电子显微镜对诱导后细胞进行鉴定。结果:①细胞形态学观察:来源于脐血的单个核细胞接种24h少量贴壁,近似圆形或短梭形;体外培养3d后可见分散的间充质干细胞小集落,集落细胞为长梭形,呈放射状生长;2周后细胞集落彼此融合,呈旋涡状或菊花状生长。传代后3周细胞基本融合成层。②细胞增殖能力检测:脐带血间充质干细胞传代后8~12h贴壁,7~13d细胞处于对数生长期,16~19d进入平台期,扩增速度快于原代培养,倍增时间为8.5d。③脐带血间充质干细胞向软骨细胞诱导分化结果:胰岛素样生长因子1诱导12d,脐带血间充质干细胞苏木精-伊红染色可见分泌少量细胞外基质。扫描电子显微镜下呈现软骨细胞特点,多边形,外围被分泌细胞外基质所围绕,呈蜘蛛网样。结论:从人脐带血中成功分离获取间充质干细胞,在体外经胰岛素样生长因子1条件培养液诱导短期内可获得软骨细胞。