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[摘 要] 目的：建立反相高效液相色谱法测定冻干粉针中DHEA含量。方法：采用Diamonsil C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，流动相为乙腈-水（55：45），流速1.0 mL · min- 1；检测波长206 nm；进样量20 μL ；柱温：室温。结果：在此色谱条件下DHEA与有关物质能达到较好分离，在0.01 mg · mL- 1～
0.7 mg · mL- 1浓度范围内与峰面积呈良好线性关系， r=0.9998；方法重复性RSD为0.42%；加样平均回收率（n=6）为98.91%。结论：该方法准确可靠，灵敏度高，专属性好，可用于测定DHEA冻干粉针含量。
[关键词] 高效液相色谱；冻干粉针；DHEA；类固醇激素
中图分类号：R917 文献标识码：A 文章编号：2095-5200（2015）05-071-03
[Abstract] Objective： To establish an RP-HPLC method for determination of the content of DHEA. Methods：Diamonsil C18 （250 mm× 4.6 mm，5 μm） column was adopted ； the mobile phase consisted of a mixture of acetonitrile - water （55：45） at the flow rate was 1.0 mL·min- 1 ；The ultraviolet detection wavelength was set at 206 nm； Loaded volume was 20 μL； the column temperature was room temperature. Results： DHEA and its related substances could be separated well. The linearity of DHEA was well correlated （ r=0.9998） within the range of 0.01 mg · mL- 1～0.7 mg · mL- 1. The method precision RSD was 0.42%. The average recoveries （n=6） was 98.91%. Conclusion： The method appeared to be accurate， reliable， sensitive， specific and can be used for the determination of the content of freeze-dried powder injection DHEA .
[Key words] HPLC；freeze-dried powder injection；DHEA； steroid hormone
引言
DHEA（脱氢表雄酮，dehydroepiandrosterone）为肾上腺及性腺分泌的一种类固醇激素，经大量研究发现，DHEA具抗衰老、预防心血管疾患、改善记忆、增强免疫力作用[1～2]，对小鼠的肝癌[3]、肺癌[4]、淋巴瘤[5] 等均有明显抑制作用；还能促进人类淋巴组织IL-2产生和释放，这正是HIV感染机体关键免疫步骤；此外，对糖尿病患者高血糖所致肾小球细胞损伤也有一定逆转作用[6]。人体试验表明，DHEA生理剂量未见明显毒副作用，但也有人对其大剂量服用带来潜在危害担忧，有试验表明[7-8]，过氧化酶体增生剂有致癌性，DHEA大剂量服用可引起肝细胞过氧化酶体增生，而低剂量无明显致过氧化酶体增生作用。因此，控制DHEA摄入量能合理有效降低其毒副作用。将DHEA做成冻干粉针注射剂，可降低给药剂量，提高生物利用度，而MATHII- AS LEBLANC等[9]研究DHEA在食蟹猴中药代动力学数据正好可以证实这一点。目前DHEA口服给药居多，DHEA冻干粉针剂是一种注射给药新剂型，本文建立简便、准确、可行、高效HPLC分析方法，用于测定冻干粉针中DHEA含量，为其质量可控奠定基础。
1 仪器与试药
仪器：Waters 2795高效液相色谱仪；2996二极管阵列检测器；Empower 数据处理系统； BP211D 型十万分之一天平；KQ3200型超声仪，UV-2501PC紫外分光光度仪。色谱柱Dikma， Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m），甲醇和乙腈均为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，甘露醇、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾均为优级纯（GR），吐温80（纯度99%）。DHEA对照品（含量：99.90%，军事医学科学院放射与辐射医学研究所自制）；DHEA冻干粉针（含主药10 mg/瓶）及空白辅料（军事医学科学院放射与辐射医学研究所自制）。
2 冻干粉针制备
按照DHEA：甘露醇：吐温80=（12：5：2）投料比，将处方量甘露醇和吐温80置研钵中，少量滴加配制好PBS缓冲液（pH=6.0） ，研匀后采用少量递加法加入已研细DHEA粉末，研磨均匀，加入PBS缓冲液，配制成每1 mL含有10 mg DHEA混悬液，再精密吸取1.0 mL置安瓿瓶中，在-40℃预冻后，抽真空并缓慢将温度升至0℃升华干燥，保持一段时间，直至含水量达1%以下，得疏松状固体后，封口即可。
3 溶液制备
3.1 对照品溶液制备
取DHEA对照品约10 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，加适量乙腈超声溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。取对照品储备液2 mL至10 mL量瓶中，加乙腈稀释至刻度摇匀，作为对照品溶液。
0.7 mg · mL- 1浓度范围内与峰面积呈良好线性关系， r=0.9998；方法重复性RSD为0.42%；加样平均回收率（n=6）为98.91%。结论：该方法准确可靠，灵敏度高，专属性好，可用于测定DHEA冻干粉针含量。
[关键词] 高效液相色谱；冻干粉针；DHEA；类固醇激素
中图分类号：R917 文献标识码：A 文章编号：2095-5200（2015）05-071-03
[Abstract] Objective： To establish an RP-HPLC method for determination of the content of DHEA. Methods：Diamonsil C18 （250 mm× 4.6 mm，5 μm） column was adopted ； the mobile phase consisted of a mixture of acetonitrile - water （55：45） at the flow rate was 1.0 mL·min- 1 ；The ultraviolet detection wavelength was set at 206 nm； Loaded volume was 20 μL； the column temperature was room temperature. Results： DHEA and its related substances could be separated well. The linearity of DHEA was well correlated （ r=0.9998） within the range of 0.01 mg · mL- 1～0.7 mg · mL- 1. The method precision RSD was 0.42%. The average recoveries （n=6） was 98.91%. Conclusion： The method appeared to be accurate， reliable， sensitive， specific and can be used for the determination of the content of freeze-dried powder injection DHEA .
[Key words] HPLC；freeze-dried powder injection；DHEA； steroid hormone
引言
DHEA（脱氢表雄酮，dehydroepiandrosterone）为肾上腺及性腺分泌的一种类固醇激素，经大量研究发现，DHEA具抗衰老、预防心血管疾患、改善记忆、增强免疫力作用[1～2]，对小鼠的肝癌[3]、肺癌[4]、淋巴瘤[5] 等均有明显抑制作用；还能促进人类淋巴组织IL-2产生和释放，这正是HIV感染机体关键免疫步骤；此外，对糖尿病患者高血糖所致肾小球细胞损伤也有一定逆转作用[6]。人体试验表明，DHEA生理剂量未见明显毒副作用，但也有人对其大剂量服用带来潜在危害担忧，有试验表明[7-8]，过氧化酶体增生剂有致癌性，DHEA大剂量服用可引起肝细胞过氧化酶体增生，而低剂量无明显致过氧化酶体增生作用。因此，控制DHEA摄入量能合理有效降低其毒副作用。将DHEA做成冻干粉针注射剂，可降低给药剂量，提高生物利用度，而MATHII- AS LEBLANC等[9]研究DHEA在食蟹猴中药代动力学数据正好可以证实这一点。目前DHEA口服给药居多，DHEA冻干粉针剂是一种注射给药新剂型，本文建立简便、准确、可行、高效HPLC分析方法，用于测定冻干粉针中DHEA含量，为其质量可控奠定基础。
1 仪器与试药
仪器：Waters 2795高效液相色谱仪；2996二极管阵列检测器；Empower 数据处理系统； BP211D 型十万分之一天平；KQ3200型超声仪，UV-2501PC紫外分光光度仪。色谱柱Dikma， Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m），甲醇和乙腈均为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，甘露醇、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾均为优级纯（GR），吐温80（纯度99%）。DHEA对照品（含量：99.90%，军事医学科学院放射与辐射医学研究所自制）；DHEA冻干粉针（含主药10 mg/瓶）及空白辅料（军事医学科学院放射与辐射医学研究所自制）。
2 冻干粉针制备
按照DHEA：甘露醇：吐温80=（12：5：2）投料比，将处方量甘露醇和吐温80置研钵中，少量滴加配制好PBS缓冲液（pH=6.0） ，研匀后采用少量递加法加入已研细DHEA粉末，研磨均匀，加入PBS缓冲液，配制成每1 mL含有10 mg DHEA混悬液，再精密吸取1.0 mL置安瓿瓶中，在-40℃预冻后，抽真空并缓慢将温度升至0℃升华干燥，保持一段时间，直至含水量达1%以下，得疏松状固体后，封口即可。
3 溶液制备
3.1 对照品溶液制备
取DHEA对照品约10 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，加适量乙腈超声溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。取对照品储备液2 mL至10 mL量瓶中，加乙腈稀释至刻度摇匀，作为对照品溶液。