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【摘 要】目的对洁净室沉降菌监测中可能影响微生物生长的各种因素进行试验分析，找出一种行之有效的操作方法。方法按《中国药典》四部9205要求对洁净室沉降菌进行监测。结果培养方式、培养基的量、沉碟暴露时间、沉降碟放置位置对最终监测结果均有一定影响。结论对洁净室进行沉降菌监测时应综合考虑各种因素的影响，以得到最客观的监测结果。
【关键词】洁净室；沉降菌；影响因素
医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法（G B/T 1 6 2 9 4一20 1 0）中规定，动态测试时，培养皿的暴露时间为不大于如，《药品生产质量管理规范》G M（P 2 01O年修订版）、欧盟EUC G M P、美国F D AC G M P中沉降菌的测试合格标准均以如为单位时间衡，但是均规定，培养皿暴露时间不得超过如，即考虑到培养皿随着放置时间的延长其培养基会因为失水等原因影响微生物正常生长。
一、洁净室的微生物检测
近年修订药品生产质量管理规范（卫生部令第79号）附录1中第十一条：应当对微生物数进行动态监测，评估无菌生产的微生物状况。监测方法有沉降菌、定量空气浮游菌、表面取样法[2]。因为浮游菌监测需要浮游菌检测仪，并且每次检测前，还需将浮游菌检测仪的采样上盖做灭菌处理，较沉降菌检测方法繁琐。因此，大多数药品生产厂家在日常监测洁净室空气中的微生物时，因实际操作比较方便的沉降菌检测法使用的频率较高。
二、沉降菌的检测
国内药品企业沉降菌的日常检测按G B/T l6294—2010《医药工业洁净室（区）沉降菌的检测方法》检测，但洁净室的平均菌落数必须低于所选定的评定标准。沉降菌检测除操作方便外，又具有费用低、对空气环境破坏小，特别是在具有层流的区域，不会干扰气流的方向，因而在洁净区的环境监测中应用广泛，。
三、仪器、设备与材料
1.仪器。全自动数显恒温鼓风干燥箱；全自动数显生化培养箱；全自动数显立式蒸汽灭菌器；生物安全柜；灭菌刻度吸管、试管、Q 90 mm×15 mm培养皿等。
2.设备。标准洁净室，T：18～26℃，RH：45%～65%。
3.培养基。胰酪大豆胨琼脂培养基；胰酪大豆胨液体培养基；沙氏葡萄糖琼脂培养基；沙氏葡萄糖琼液体养基。所有制备好的培养基均照《中国药典》2015年版（四部）1421“灭菌法”操作，在121℃灭菌20 min。
4.验证试验用菌种。金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、铜绿假单胞菌[CMCC（B）（10104）]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）（63501）]、白色念珠菌[CMCC（F）（98001）]、黑曲霉菌[CMCC（F）（98003）。所有实验用菌种均为第三代。
四、方法
1.菌液制备。取经30～35℃培养18～24 h的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌与枯草芽孢杆菌的胰酪大豆胨液体培养基培养物1 mL分别加至9 mL 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释成相应浓度且含菌数小于100 cfu/mL的菌悬液备用。取经20～25℃培养2～3 d的白色念珠菌的沙氏葡萄糖液体培养基培养物1 mL，加入9 mL 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至相应浓度且含菌数小于100 cfu/mL的菌悬液备用。取经20～25℃培养5～7 d的黑曲霉菌的沙氏葡萄糖琼脂培养物，加2 mL 0.9%无菌氯化钠溶液，洗下孢子，转移至另一空管，取1 mL加至9 mL 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释成相应浓度且含孢子数小于100 cfu/mL的孢子悬液备用。
2.方法验证。培养基适用性检查：每次均以两个平皿在操作台暴露4 h作为阴性对照。（1）培养基失重情况考察（单位：g）。①取制备好的胰酪大豆胨琼脂培养基沉降碟（培养基量30 mL）先在30～35℃常规预培养48 h后在洁净室动态环境下暴露4 h，再依法培养。②取制备好的胰酪大豆胨琼脂培养基沉降碟（培养基量30 mL）以双层透明无菌袋包装烫封后先在30～35℃预培养48 h后，在洁净室动态环境下暴露4 h，再依法培养。（2）培养基量对微生物生长的影响。依法制备胰酪大豆胨琼脂培养基沉降碟45个（培养基加入量分别为：20、30、40 mL各15个），以双层透明无菌袋包装烫封后在30～35℃培养48 h，无菌生长。在洁净室操作台均匀放置，动态暴露4 h后，取不同培养基量的沉降碟分为5组分别接种。接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌菌液的，于30～35℃培养2 d；接种白色念珠菌、黑曲霉菌液的，于20～25℃培养5 d。点计菌落数，取平均值计算比值。（3）暴露时间对微生物生长的影响。依法制备胰酪大豆胨琼脂培养基沉降碟60个（培养基加入量30 mL）以双层透明无菌袋包装烫封后在30～35℃培养48 h，无菌生长。分成4组，每组15个，在洁净室操作台均匀放置，动态暴露时间分布为1、2、3、4 h，取不同暴露时间的沉降碟分为5组分别接种。接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌菌液的，于30～35℃培养2 d；接种白色念珠菌、黑曲霉菌菌液的，于20～25℃培养5 d。点计菌落数，取平均值计算比值。结（4）培养方式对微生物生长的影响。①培养方式1：常规培养。依法制备胰酪大豆胨琼脂培养基沉降碟15个（培养基加入量30 mL）以双层透明无菌袋包装烫封后在30～35℃培养48 h，无菌生长。在洁净室操作台均匀放置，动态暴露4 h后，分为5组分别接种。接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌菌液的，于30～35℃培养2 d；接种白色念珠菌、黑曲霉菌菌液的，于20～25℃培养5 d。点计菌落数，取平均值计算比值。
3.讨论。（1）培养基失重情况考察。因为采用的沉降碟不是终端灭菌，制备好后要100%进行预培养。常规预培养后依法操作，培养基总失重平均占比情况（失重率%）。说明采用密封预培养能明显减少预培养过程中的水分损失，同时在沉降菌监测中沉降碟不应放置于通风口附近。因为不同洁净室或生产车间环境条件不一样，受温度湿度及层流的风速的影响，培养基失重数据会有一定波动。（2）培养基量干扰培养结果。培养基为20、30、40 mL验证测得比值均在0.5～2范围内。但培养基量以30～40 mL为宜；20 mL量较少，水份损失后对微生物生长有一定影响，例如铜绿假单胞菌，比值仅为0.59；实际操作时不可能采用量器加培养基，加量不会很精准，多于40 mL已接近培养皿上沿，操作不当可能导致培养基溢出，同时黑曲霉培养5 d后已生成较为丰富的菌丝，如接触皿盖，造成计数困难，且孢子一旦逸出则会导致严重的环境污染。
随着我国药品G M PS U度的发展，对药品生产中洁净室控制的要求越来越高，医药生产洁净室属于一般生物洁净室，主要控制有生命的微粒兼尘埃微粒对产品的污染。药厂应自觉按照G M P的要求，对洁净区域制定系统的环境监测方案，以有代表性的、准确的数据评价环境的微生物分布情况，判定洁净区环境是否处于良好的受控状态下运行。要做到这些，正确的方法是关键性的。
参考文献：
[1]毛小晓.现代医药工业微生物實验室质量管理与验证技术[M].中国协和医科大学出版社.2014
[2]任毛.灭菌制剂室空气中尘埃粒子测定试验[J].西北药学杂志，201，6（1）：22.
[3]潘小艺.现代医药工业微生物实验室质量管理与验证技术[M].中国协和医科大学出版社.
[4]李丽.灭菌制剂室空气中尘埃粒子测定试验[J].西北药学杂志，2014，6（1）：22.
（作者单位：天津津环医净空气检测技术有限公司）
【关键词】洁净室；沉降菌；影响因素
医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法（G B/T 1 6 2 9 4一20 1 0）中规定，动态测试时，培养皿的暴露时间为不大于如，《药品生产质量管理规范》G M（P 2 01O年修订版）、欧盟EUC G M P、美国F D AC G M P中沉降菌的测试合格标准均以如为单位时间衡，但是均规定，培养皿暴露时间不得超过如，即考虑到培养皿随着放置时间的延长其培养基会因为失水等原因影响微生物正常生长。
一、洁净室的微生物检测
近年修订药品生产质量管理规范（卫生部令第79号）附录1中第十一条：应当对微生物数进行动态监测，评估无菌生产的微生物状况。监测方法有沉降菌、定量空气浮游菌、表面取样法[2]。因为浮游菌监测需要浮游菌检测仪，并且每次检测前，还需将浮游菌检测仪的采样上盖做灭菌处理，较沉降菌检测方法繁琐。因此，大多数药品生产厂家在日常监测洁净室空气中的微生物时，因实际操作比较方便的沉降菌检测法使用的频率较高。
二、沉降菌的检测
国内药品企业沉降菌的日常检测按G B/T l6294—2010《医药工业洁净室（区）沉降菌的检测方法》检测，但洁净室的平均菌落数必须低于所选定的评定标准。沉降菌检测除操作方便外，又具有费用低、对空气环境破坏小，特别是在具有层流的区域，不会干扰气流的方向，因而在洁净区的环境监测中应用广泛，。
三、仪器、设备与材料
1.仪器。全自动数显恒温鼓风干燥箱；全自动数显生化培养箱；全自动数显立式蒸汽灭菌器；生物安全柜；灭菌刻度吸管、试管、Q 90 mm×15 mm培养皿等。
2.设备。标准洁净室，T：18～26℃，RH：45%～65%。
3.培养基。胰酪大豆胨琼脂培养基；胰酪大豆胨液体培养基；沙氏葡萄糖琼脂培养基；沙氏葡萄糖琼液体养基。所有制备好的培养基均照《中国药典》2015年版（四部）1421“灭菌法”操作，在121℃灭菌20 min。
4.验证试验用菌种。金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、铜绿假单胞菌[CMCC（B）（10104）]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）（63501）]、白色念珠菌[CMCC（F）（98001）]、黑曲霉菌[CMCC（F）（98003）。所有实验用菌种均为第三代。
四、方法
1.菌液制备。取经30～35℃培养18～24 h的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌与枯草芽孢杆菌的胰酪大豆胨液体培养基培养物1 mL分别加至9 mL 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释成相应浓度且含菌数小于100 cfu/mL的菌悬液备用。取经20～25℃培养2～3 d的白色念珠菌的沙氏葡萄糖液体培养基培养物1 mL，加入9 mL 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至相应浓度且含菌数小于100 cfu/mL的菌悬液备用。取经20～25℃培养5～7 d的黑曲霉菌的沙氏葡萄糖琼脂培养物，加2 mL 0.9%无菌氯化钠溶液，洗下孢子，转移至另一空管，取1 mL加至9 mL 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释成相应浓度且含孢子数小于100 cfu/mL的孢子悬液备用。
2.方法验证。培养基适用性检查：每次均以两个平皿在操作台暴露4 h作为阴性对照。（1）培养基失重情况考察（单位：g）。①取制备好的胰酪大豆胨琼脂培养基沉降碟（培养基量30 mL）先在30～35℃常规预培养48 h后在洁净室动态环境下暴露4 h，再依法培养。②取制备好的胰酪大豆胨琼脂培养基沉降碟（培养基量30 mL）以双层透明无菌袋包装烫封后先在30～35℃预培养48 h后，在洁净室动态环境下暴露4 h，再依法培养。（2）培养基量对微生物生长的影响。依法制备胰酪大豆胨琼脂培养基沉降碟45个（培养基加入量分别为：20、30、40 mL各15个），以双层透明无菌袋包装烫封后在30～35℃培养48 h，无菌生长。在洁净室操作台均匀放置，动态暴露4 h后，取不同培养基量的沉降碟分为5组分别接种。接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌菌液的，于30～35℃培养2 d；接种白色念珠菌、黑曲霉菌液的，于20～25℃培养5 d。点计菌落数，取平均值计算比值。（3）暴露时间对微生物生长的影响。依法制备胰酪大豆胨琼脂培养基沉降碟60个（培养基加入量30 mL）以双层透明无菌袋包装烫封后在30～35℃培养48 h，无菌生长。分成4组，每组15个，在洁净室操作台均匀放置，动态暴露时间分布为1、2、3、4 h，取不同暴露时间的沉降碟分为5组分别接种。接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌菌液的，于30～35℃培养2 d；接种白色念珠菌、黑曲霉菌菌液的，于20～25℃培养5 d。点计菌落数，取平均值计算比值。结（4）培养方式对微生物生长的影响。①培养方式1：常规培养。依法制备胰酪大豆胨琼脂培养基沉降碟15个（培养基加入量30 mL）以双层透明无菌袋包装烫封后在30～35℃培养48 h，无菌生长。在洁净室操作台均匀放置，动态暴露4 h后，分为5组分别接种。接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌菌液的，于30～35℃培养2 d；接种白色念珠菌、黑曲霉菌菌液的，于20～25℃培养5 d。点计菌落数，取平均值计算比值。
3.讨论。（1）培养基失重情况考察。因为采用的沉降碟不是终端灭菌，制备好后要100%进行预培养。常规预培养后依法操作，培养基总失重平均占比情况（失重率%）。说明采用密封预培养能明显减少预培养过程中的水分损失，同时在沉降菌监测中沉降碟不应放置于通风口附近。因为不同洁净室或生产车间环境条件不一样，受温度湿度及层流的风速的影响，培养基失重数据会有一定波动。（2）培养基量干扰培养结果。培养基为20、30、40 mL验证测得比值均在0.5～2范围内。但培养基量以30～40 mL为宜；20 mL量较少，水份损失后对微生物生长有一定影响，例如铜绿假单胞菌，比值仅为0.59；实际操作时不可能采用量器加培养基，加量不会很精准，多于40 mL已接近培养皿上沿，操作不当可能导致培养基溢出，同时黑曲霉培养5 d后已生成较为丰富的菌丝，如接触皿盖，造成计数困难，且孢子一旦逸出则会导致严重的环境污染。
随着我国药品G M PS U度的发展，对药品生产中洁净室控制的要求越来越高，医药生产洁净室属于一般生物洁净室，主要控制有生命的微粒兼尘埃微粒对产品的污染。药厂应自觉按照G M P的要求，对洁净区域制定系统的环境监测方案，以有代表性的、准确的数据评价环境的微生物分布情况，判定洁净区环境是否处于良好的受控状态下运行。要做到这些，正确的方法是关键性的。
参考文献：
[1]毛小晓.现代医药工业微生物實验室质量管理与验证技术[M].中国协和医科大学出版社.2014
[2]任毛.灭菌制剂室空气中尘埃粒子测定试验[J].西北药学杂志，201，6（1）：22.
[3]潘小艺.现代医药工业微生物实验室质量管理与验证技术[M].中国协和医科大学出版社.
[4]李丽.灭菌制剂室空气中尘埃粒子测定试验[J].西北药学杂志，2014，6（1）：22.
（作者单位：天津津环医净空气检测技术有限公司）